[發(fā)明專利]靶向人巨細(xì)胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811100890.8
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN109321572A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尚世強(qiáng);舒強(qiáng);陶然;李偉;李華美;劉麗芳
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/867
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發(fā)明提供一種靶向人巨細(xì)胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列，其核苷酸序列是：5’?TTGGGCATGTGTATATATAAA?3’。本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇的siRNA的cDNA序列GC含量為28.6％。構(gòu)建靶向人巨細(xì)胞病毒lncRNA4.9的siRNA慢病毒載體，進(jìn)行慢病毒包裝后感染人巨細(xì)胞病毒潛伏感染的細(xì)胞模型，能有效降低lncRNA4.9的核酸水平，可應(yīng)用于體內(nèi)外人巨細(xì)胞病毒lncRNA4.9及其調(diào)控蛋白的功能研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及靶向人巨細(xì)胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列的設(shè)計(jì)、篩選以及在體內(nèi)外研究lncRNA4.9及其調(diào)控蛋白功能中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)為皰疹病毒科β屬的雙鏈DNA病毒，其感染在人群中極為普遍，成年人血清抗體陽性率高達(dá)90％以上。原發(fā)性HCMV感染大多呈無癥狀的隱性感染，病毒可長期潛伏在體內(nèi)，甚至終生帶毒，但在免疫功能缺陷人群中潛伏的HCMV可被激活而引起嚴(yán)重疾病。HCMV還可通過胎盤、產(chǎn)道、母乳等途徑在母嬰間傳播，是目前公認(rèn)的引起先天性感染最常見的病原體，先天性感染的發(fā)生率約占活產(chǎn)兒的0.2％-2.2％。先天性HCMV感染不僅會(huì)造成流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、宮內(nèi)發(fā)育遲緩等嚴(yán)重后果，在無癥狀感染患兒中導(dǎo)致的遲發(fā)性后遺癥也不容忽視。據(jù)報(bào)道，約5％至17％的無癥狀先天性HCMV感染患兒在出生后表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括感覺神經(jīng)性耳聾、智力發(fā)育延遲、運(yùn)動(dòng)障礙、癲癇、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎等。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度＞200nt且不表現(xiàn)任何蛋白質(zhì)編碼潛能的非編碼RNA。越來越多的研究表明，lncRNA參與了細(xì)胞生理、病理的各個(gè)過程。目前已知lncRNA的作用方式有兩種：①轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，如lncRNA可以識(shí)別、結(jié)合到靶基因的基因組功能區(qū)(啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)等)，并招募某些功能蛋白來調(diào)控靶基因的表達(dá)；②轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，即lncRNA也可與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，從而影響靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪切、拼接及翻譯。

目前已知參與HCMV感染過程的病毒lncRNA主要包括lncRNA1.2、lncRNA2.7、lncRNA4.9和lncRNA5.0，部分lncRNA的調(diào)控作用已獲得證實(shí)，如lncRNA2.7可通過與線粒體酶復(fù)合物結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡，lncRNA5.0與HCMV的毒力有密切關(guān)系。lncRNA4.9直到最近才從HCMV表達(dá)譜中被確認(rèn)，其轉(zhuǎn)錄本長度為4922bp。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV增殖感染72小時(shí)后才能檢測到lncRNA4.9，且lncRNA4.9在HCMV增殖感染過程中維持低水平；而在HCMV潛伏感染的細(xì)胞中則可檢測到高水平的lncRNA4.9，抑制lncRNA4.9后潛伏感染的HCMV會(huì)被激活。免疫共沉淀研究進(jìn)一步揭示，lncRNA4.9可與多聚抑制復(fù)合物作用，并識(shí)別和結(jié)合在HCMV即刻早期基因IE2的啟動(dòng)子區(qū)，抑制IE2的轉(zhuǎn)錄，推測lncRNA4.9可能通過調(diào)控IE2的表達(dá)水平參與HCMV的潛伏感染。但迄今為止lncRNA4.9的確切作用機(jī)制，及其調(diào)控靶蛋白的種類和功能仍有待進(jìn)一步研究。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是序列特異的雙鏈RNA使細(xì)胞內(nèi)同源mRNA降解，從而產(chǎn)生特異性基因表達(dá)沉默的過程。RNAi的作用主要由長約21～23nt的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)介導(dǎo)，由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特異性降解，因此要產(chǎn)生有效RNAi的關(guān)鍵是選擇合適的siRNA作用靶點(diǎn)。RNAi靶點(diǎn)的選擇原則主要包括：①從靶基因起始密碼子下游50～100nt開始查找；②選擇GC含量在25％-65％左右的mRNA區(qū)域；③避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列；④保證靶序列與其他基因沒有同源性。制備siRNA的方法主要包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、長片段dsRNA經(jīng)RNaseⅢ降解法、siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄法及PCR制備的siRNA表達(dá)框法等5種。目前，RNAi已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容