[發(fā)明專利]一種H7亞型禽流感病毒檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811095713.5
• 申請日: 2018-09-19
• 公開（公告）號: CN109112231A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王楷宬;王素春;黃保續(xù)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明提供一種基于分子生物學的快速檢測H7亞型禽流感病毒的方法，以實現(xiàn)對H7亞型禽流感病毒進行安全、特異、快速、靈敏、簡單的快速檢測，從而彌補現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足。與普通的RT?PCR法相比，RT?RAA法是在恒溫條件下反應(yīng)，操作簡單，擺脫了復(fù)雜儀器的束縛，不需變溫，大大縮短了反應(yīng)時間，非常適用于現(xiàn)場應(yīng)急快速檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫擴增(Reverse transcription recombinaseaided amplification，RT-RAA)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種H7亞型流感病毒的檢測方法，包括檢測過程中使用的引物對和探針。

背景技術(shù)

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)為單股負鏈RNA病毒，由8個獨立的RNA節(jié)段組成，顯著的生物學特征之一是亞型眾多，變異頻繁。迄今為止從禽類體內(nèi)已經(jīng)分離到上千種毒力各異的毒株，根據(jù)其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異，分為8種HA亞型(H1-H18)和11種NA亞型(N1-N11)。同亞型毒株對宿主的致病力差異顯著，在所有HA亞型中，只有H5和H7亞型對禽是高致病性的，稱為高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)。近年來時有H7亞型流感病毒爆發(fā)，如1999～2000年在意大利爆發(fā)的H7N1病毒導(dǎo)致1300多萬羽雞死亡，造成重大經(jīng)濟損失。2003年荷蘭爆發(fā)了H7N7亞型禽流感，不僅造成了重大的經(jīng)濟損失，而且感染89人。自2013年2月以來，我國華東地區(qū)上海市、安徽省、江蘇省、浙江省先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例，于3月31日將其確診為人感染H7N9亞型禽流感病毒。

目前檢測H7亞型禽流感病毒主要是通過實時熒光定量RT-PCR方法和RT-PCR方法，這兩種方法均需要精密的實驗儀器，且耗時較長，適用于在實驗室進行檢測，從樣品采集、運送至實驗室到獲得檢測結(jié)果至少需要一天時間，會延誤疫病確認和防控工作。本發(fā)明中的檢測方法是一種通過逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)的等溫擴增方法，操作簡單、用時短，儀器小巧可移動，可在養(yǎng)殖場、活禽交易市場和檢疫站等進行該病的現(xiàn)場快速檢測，為疫病的早期防控爭取寶貴的時間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種H7亞型禽流感病毒的檢測方法，以實現(xiàn)對H7亞型禽流感病毒進行安全、特異、靈敏、快速、方便的檢測。

本發(fā)明首先提供一種檢測H7亞型禽流感病毒的引物對和探針組，分別是鑒定H7亞型禽流感病毒HA基因的引物對H7 forward、H7 reverse和探針H7 probe，其引物對和探針序列信息如下：

正向引物H7 forward：

5′-CCTATGATCACAGYAAATACAGGGAAGAGGCAAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H7reverse：

5′-CTAGAAGTATGAAACATGATGCCCCGAAGCTAA-3′(SEQ ID NO:2)

探針H7 probe：

5′-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACATCCT/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/AGCCGCTGCTTAGTTTGAC-3′；

其中探針自5′端起第29位堿基標記FAM發(fā)光基團，第29位堿基后連接脫堿基位點四氫呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第30位堿基標記BHQ1淬滅基團，3′端進行C3-spacer阻斷修飾。

本發(fā)明還提供一種用于檢測H7亞型禽流感病毒的制品，所述的制品使用了上述的引物對和探針；

所述的制品，還包含有逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫擴增的試劑。

本發(fā)明再一個方面提供檢測臨床樣品中H7亞型禽流感病毒的RT-RAA檢測方法，包括如下的步驟：