[發明專利]一種生產米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的工程菌株及其構建方法

在審

• 申請號: 201811092260.0
• 申請日: 2018-09-19
• 公開（公告）號: CN110923259A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 黃金金;陳凌霄;趙慶伊;鄭維發
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/55;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 周敏

一種生產米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶mRML酶粉的工程菌株及其構建方法，將含前導肽的脂肪酶基因mrml插入到巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZα+Mα上構建得到含目的基因的表達載體pPICZαA?mrml，將含有目的基因的表達載體轉到巴斯德畢赤酵母X?33中并篩選獲得含mrml基因的能夠表達mRML的工程菌zα?mRML?X33。將上述工程菌株進行搖瓶發酵，胞外酶活為98U/mL。將該菌株產生的發酵液用丙酮制備酶粉，當發酵液pH調整到5.0?7.0，丙酮和發酵液的體積比為2:1時，酶活回收率保持在70％以上。當發酵液pH為7.0時，酶回收率最高，獲得酶粉的重量為1.373g，酶粉的比活為3367U/g，酶粉的回收率為94.4％。為該酶的儲存、運輸和使用提供新的方式。

技術領域

本發明涉及分子生物學、基因工程領域，具體涉及一種生產米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的工程菌株及其構建方法。

背景技術

脂肪酶(E C3.1.1.3)是可以水解三酰甘油的一類酶，可催化多種化學反應如：水解、酯化、轉酯化、氨解等，且具有反應條件溫和、專一性強、無污染等優點被廣泛的應用于食品、醫藥、化妝品、石油等行業，被稱之為第三大工業用酶。酶粉是常用的保存酶的形式之一，具有方便保存、運輸和穩定性好等優點。米黑根毛霉脂肪酶是一種1，3位置專一性的脂肪酶，可被用于制備奶味香精、生產生物柴油等多個方面。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高產、穩定的生產米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的工程菌株及其構建方法。

作為本發明的第一方面，提供了一種生產米黑根毛霉脂肪酶酶粉的工程菌株的構建方法，包括步驟，

一種生產米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉的方法，包括步驟：

S1：將含前導肽的脂肪酶基因mrml插入到表達載體上，構建得到含目的基因的表達載體；

S2：將含有目的基因的表達載體轉到宿主細胞中；

S3：篩選獲得含mrml基因的能夠表達mRML的工程菌株。

優選的，所述表達載體為巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZαA，所述含目的基因的表達載體為pPICZαA-mrml。

優選的，所述宿主細胞為巴斯德畢赤酵母X-33。

作為本發明的第二方面，提供了由上述的生產米黑根毛霉脂肪酶mRML酶粉工程菌株的構建方法所制備的工程菌株。

本發明的有益效果：本發明通過篩選高拷貝數的工程菌株，構建恰當的表達載體，得到一株產生UPR反應的異源表達脂肪酶的菌株，并在該菌株中過表達HAC1，獲得一株脂肪酶分泌效率得到明顯提高的菌株本研究將米黑根毛霉脂肪酶mRML在畢赤酵母中表達，獲得產米黑根毛霉脂肪酶mRML的菌株的進行搖瓶發酵，胞外酶活為98U/mL。將胞外產生的米黑根毛霉脂肪酶通過丙酮沉淀，制備得到米黑根毛霉脂肪酶mRML的酶粉。將50mL發酵液pH調整到5.0-7.0，丙酮和發酵液的體積比為2:1，酶活回收率保持在70％以上。當發酵液pH為7.0時，酶回收率最高，獲得酶粉的重量為1.373g，酶粉的比活為3367U/g，酶粉的回收率為94.4％。明顯優于現有的異源表達脂肪酶的工程菌株。

附圖說明

圖1 pPICZαA-mrml表達質粒構建流程圖；

圖2 zα-mRML-X33搖瓶發酵產酶。

具體實施方式：