[發明專利]一種拮抗桉樹青枯病的芽孢桿菌的篩選方法

在審

• 申請號: 201811090208.1
• 申請日: 2018-09-18
• 公開（公告）號: CN109251873A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 吳志華;李超;謝耀堅;尚秀華;方良
• 申請（專利權）人: 國家林業局桉樹研究開發中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04
• 代理公司: 北京匯彩知識產權代理有限公司 11563
• 代理人: 董麗萍

本發明公開了一種拮抗桉樹青枯病的芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：備選芽胞桿菌分離培養準備,對土壤芽孢桿菌分離純化培養，或已經獲得了分離純化芽孢桿菌菌株；桉樹青枯病原菌的培養及菌培養液的制備；在桉樹青枯病菌株培養液基礎上加入刃天青鹽指示劑，加入各種待測芽孢桿菌樣品以建立桉樹青枯病病菌混合培養體系；并進行培養12小時；對培養后的桉樹青枯病混合培養體系的圖像進行顏色特征R值提取；通過對照組和處理組的分析比較以確定測試菌株拮抗桉樹青枯病的能力以篩選高效拮抗的芽孢桿菌生防菌。本方法操作簡便，無需要進行營養平板上進行桉樹青枯病病原菌進行對峙培養，可以快速、高效地篩選出具有拮抗的桉樹青枯病的芽孢桿菌。

技術領域

本發明涉及林業生物防治領域，具體涉及一種拮抗桉樹青枯病的 芽孢桿菌的篩選方法。

背景技術

桉樹是我國南方速生豐產商品林的重要樹種，廣東、廣西及海南 三省是我國桉樹人工商品林主產區，種植面積達440萬hm2，占我國 桉樹人工林總面積的76％。青枯病(Bacterialwilt)是由勞爾氏菌 (Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病是一種土傳病害，因具有 遺傳多樣性,其寄主、地理分布、致病性以及生物型均有差異，植株 一旦感病，很難防治。桉樹青枯病是我國桉樹人工林生產的重要病害， 隨著桉樹人工林的不斷增加，青枯病的發生日趨嚴重，已成為當前發 展桉樹生產的主要障礙之一。青枯病危害嚴重且控制難度較大，利用 有益生物或其他生物來抑制或消滅有害生物以達到控制植物病害的 目的，是一種綠色、環保的防治方法,因此應用高效拮抗微生物是預 防桉樹青枯病發生的有效手段之一。

刃天青是氧化還原反應的指示劑,由于其的氧化態和還原態具有 不同的顏色。當溶液中滴定體系電對的點位改變時，指示劑電對的濃 度也發生改變，因而引起溶液顏色變化。當有溶液中有細菌等微生物 生長繁殖時,其代謝能使刃天青還原，并發生不可逆的顏色改變,從藍 紫色→紅紫色→淡紅紫色→粉紅色→淡粉紅色→白色的顏色變化,很 容易監控或被監控到。根據刃天青的顏色變化判斷是否有微生物代謝 活動。

常規拮抗菌的篩選過程比較繁雜，一般來說，拮抗菌的篩選首 先需要對采集來的樣品系列稀釋后在營養平板上涂布培養，然后把平 板上生長出來的所有細菌一一挑取后在另一個營養平板上純化，純化 后再把細菌一一接種到另一種營養平板上和病原菌進行對峙培養，通 過對所有細菌進行拮抗能力的測定最終篩選到拮抗微生物，由于土壤 和植株中微生物種類繁多，而拮抗菌所占的比例又非常少，而且平板 上的好多細菌是同一個菌株，但是依靠菌株形態很難判斷是不是同一 個菌，所以在分離細菌、細菌純化和對峙培養過程需要大量的培養基 和大量的分離、純化和拮抗能力測定的工作。正是由于這種篩選方法 過程繁瑣，效率低，造成沒有更多的時間和精力進行廣泛的樣品采集， 以增加拮抗菌篩選的范圍，從而提高篩選到高效拮抗菌的可能性。

傳統的芽胞桿菌生防菌篩選方法多是以純化好的菌株然后與篩 選的微生物進行平板共培養的對峙試驗，以確定是否存在抑菌圈，通 過對所有細菌進行拮抗能力的測定最終篩選到拮抗微生物，由于土壤 中微生物種類繁多，而拮抗菌所占的比例又極少，所以在分離細菌、 細菌純化和對峙培養過程需要作大量的培養基和大量的分離、純化和 拮抗能力測定等工作。因此采用傳統的的這種生防菌篩選方法工作量 大，費時費力，效率低。

發明內容

本發明的目的在于針對傳統拮抗桉樹青枯病芽孢桿菌篩選繁瑣 且效率較低的難題，提供一種拮抗桉樹青枯病病菌快速篩選方法，解 決了拮抗桉樹青枯病病菌大規模篩選工作量大、時間長的問題。本發 明采用刃天青作為指示劑添加在芽孢桿菌與桉樹青枯病病菌混合培 養體系，通過培養后，以常見的數碼相機獲得其反應體系的圖像，通 過提取圖像顏色特征和參數比較篩選拮抗菌株。該方法反應體系小、 節省材料時間，且篩選準確率高，為拮抗桉樹青枯的芽孢桿菌大規模 篩選提供一條快捷有效的途徑。

主要是通過土壤微生物芽孢桿菌與桉樹青枯病病原菌相互作用 時的競爭作用及抗生作用等相結合，在較小的培養體系中通過指示劑 顏色反應出芽孢桿菌不同拮抗情況。