[發明專利]一種基于斑馬魚激素水平響應的水環境內分泌干擾效應評價方法

在審

• 申請號: 201811057672.0
• 申請日: 2018-09-11
• 公開（公告）號: CN109283306A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 楊方星
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種基于斑馬魚激素水平響應的水環境內分泌干擾效應評價方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)斑馬魚暴露實驗：斑馬魚暴露實驗在恒溫且恒光照的條件下進行，所述恒溫溫度為27.5℃-29.5℃，所述恒光照的光、暗時間每天分別為14h和10h。暴露分為對照組和實驗組，每組放置成年斑馬魚雌雄各10條，且雌雄分開暴露于裝置內。暴露期間，每天喂食一次，并更換裝置內一半的水。暴露結束后，對每條魚稱重后各加1mL超純水進行勻漿。勻漿液用離心機2500×g離心10min后，取上清液保存于-80℃冰箱內待分析。

(2)液質聯用技術同時定量分析斑馬魚體內多種蛋白生物標志物：分析用的是2.1mm×50mm、1.7μm的Waters BEH C18柱，并在前端串聯一根VanGuard^TM保護柱，所述VanGuard^TM保護柱為2.1mm×50mm、1.7μm的C18柱。流動相用二元洗脫液，A路水，B路乙腈，均添加體積濃度為0.1％的氨水，流速為0.3mL/min，進樣量為10μL。設置的梯度是：0min，5％B；4min，25％B；8min，95％B；10min，5％B，所述比例均為體積比。質譜使用選擇反應監測模式。毛細管電壓為1.07kV。氮氣用作脫溶劑氣，氣體的溫度和流速分別為為350℃和800L/h。氬氣為碰撞氣。通過分析測定，得到下表所示的每種蛋白生物標志物的濃度。

(3)以斑馬魚激素響應指數對生物標志物響應進行統一量化：將斑馬魚體內類固醇類激素、氨基酸衍生物類激素、脂肪酸衍生物類激素等多種激素的差異表達進行整合，形成斑馬魚激素響應指數。斑馬魚激素響應指數Z_HIBR的計算具體為：計算每種激素生物標志物重復樣的平均值X，令Y＝(X-m)/s，其中m和s分別為每種激素生物標志物所有實驗水平下的總體平均值和標準偏差。當生物標志物的響應為激活時，令Z＝Y；當生物標志物的響應為抑制時，令Z＝-Y。取所有實驗水平下Z值最小值Min，將其絕對值與Z相加得到每種生物標志物的得分S，S＝Z+|Min|。利用星狀圖表示生物標志物的結果，每種生物標志物的S值以星狀圖中輻射線長度表示，水環境的IBR值通過計算星狀圖面積即相鄰生物標志物的輻射線所圍成的三角形面積之和獲得。A_i為第i個和第i+1個輻射線形成的三角形面積，可通過下式計算：其中，α是相鄰兩條輻射線的夾角，n是測定的生物標志物的個數，總面積即為斑馬魚激素響應指數，各暴露組的斑馬魚激素響應指數與對照組比較以確定暴露水體的內分泌干擾效應等級和程度。