[發明專利]基于器官芯片的低氧模擬人早期胎盤發育微環境的方法

有效

• 申請號: 201811040903.7
• 申請日: 2018-09-07
• 公開（公告）號: CN110885780B
• 公開（公告）日: 2023-02-21
• 發明（設計）人: 秦建華;王慧;朱玉娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

1.一種基于器官芯片的低氧模擬人早期胎盤發育微環境的方法，其特征在于：采用了一種三維基質材料，即人工基底膜Matrigel，按照以下步驟進行：

(1)孔板修飾與人多能干細胞接種培養

先用人工基底膜修飾6孔板并放于4°冰箱4小時-7天，之后放入37°培養箱20-50min，用細胞消化液室溫消化；用細胞刮板刮下細胞團，600r離心1-3min，細胞用含Y27632的mTeSR1培養基重懸使細胞為小團塊后接種于已修飾好的6孔板，37°培養1-4h后將培養液更換為不含Y27632的mTeSR1培養基培養；

(2)細胞消化并接種于三維基質中

待hPSC細胞生長為70％-90％后用消化液室溫消化，用細胞刮板刮下細胞團，離心600r1-3min，將上清液體吸走，用含BMP4的誘導hPSC分化的培養基將matrigel稀釋到一定比例后將細胞重懸得到合適的接種密度并接種，37°培養箱放置20-40min使懸有細胞的matrigel固化，之后更換為含BMP4的誘導hPSC分化的培養基；

(3)氧氣濃度下早期胎盤發育模型的建立

接以上步驟(2)每天更換培養基，培養基仍為步驟(2)中含BMP4的誘導hPSC分化的培養基，不同氧氣濃度模型建立若干天；

(4)細胞形態及功能表征

采用常規免疫熒光染色法檢測E-cadherin、F-actin、HIF-1a的表達，采用實時PCR法檢測HIF通路相關的基因表達； 步驟(1)所述人工基底膜修飾6孔板具體為：將人工基底膜稀釋500-1000倍，每孔1.5ml稀釋液，放于4°冰箱4小時-7天；

所述含Y27632的mTeSR1培養基中，Y27632的濃度范圍為1-100mM；

步驟(2)所述matrigel稀釋具體為培養基：matrigel的體積比為為0-3:1，細胞接種密度為1×10⁴-1×10¹⁰cells/ml；

步驟(2)所述含BMP4的誘導hPSC分化的培養基成分為：體積濃度96％的DMED/F12、體積濃度1％的雙抗、體積濃度1％的谷氨酰胺、體積濃度1％的非必須氨基酸(MEMNEAA)、體積濃度1％的ITS、100ng/ml的肝素、10ng/ml的BMP4，由此配置的每50ml培養基中添加1gBSA，溶解后即為含BMP4的誘導hPSC分化的培養基；

步驟(3)所述氧氣濃度范圍為2％-21％，模型建立時間為3-15天。