[發明專利]多交叉擴增結合納米生物傳感器檢測鉤端螺旋體的方法

有效

• 申請號: 201811040029.7
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109112186B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 李世軍;劉英
• 申請（專利權）人: 貴州省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一種多交叉恒溫擴增結合高分子納米生物傳感器檢測鉤端螺旋體的方法，所述方法使用獨特設計的多交叉置換擴增引物，同時提供在多交叉置換擴增中的擴增引物C1的5’端標記生物素的引物，以及在擴增引物D1的5’端標記半抗原的引物。所述方法針對致病性鉤端螺旋體LipL41基因的擴增產物能被高分子納米生物傳感器可視化檢測。所述方法便捷、快速、敏感、特異，適宜于致病性鉤端螺旋體的特異檢測。

技術領域

本發明公開了一種致病性鉤端螺旋體的檢測方法，屬于微生物檢測領域。

背景技術

鉤端螺旋體(Leptospira)是一種菌體纖細，長短不一，一般為6～20um，寬0.1～0.2um，具有細密而規則螺旋的細菌，菌體一端或兩端彎曲呈鉤狀，常為“c”、“s”等形狀。在暗視野顯微鏡下可見鉤體像一串發亮的微細珠粒，運動活潑，可曲屈，前后移動或圍繞長軸作快速旋轉。電鏡下鉤體為圓柱狀結構，最外層是鞘膜，由脂多糖和蛋白質組成，其內為胞壁，再內為漿膜，在胞壁與漿膜之間有一根由兩條軸絲扭成的中軸，位于菌體一側。鉤體是以整個圓柱形菌體纏繞中軸而成，鉤體的胞壁成份與革蘭氏陰性桿菌相似。

鉤端螺旋體可分為致病性鉤體(Pathogenic Leptospira)及非致病性鉤體(Non-pathogenic Leptospira)兩大類。由致病性鉤端螺旋體感染引起的鉤體病是全球流行的人獸共患傳染病。由于鉤體通過疫水迅速傳播，因而是洪澇、地震等自然災害發生時重點檢測的傳染病之一。我國自然災害頻發，大部分地區有鉤體病流行，因此，鉤體病被列入我國13種國家監控傳染病及15種國家計劃免疫項目之列。

致病性鉤體分為若干基因種，其中以問號鉤體(L.interrogans)流行最廣，對人和動物的危害也最為嚴重。問號鉤體血清群、型眾多，問號鉤體黃疸出血群的賴型和波摩那群的波摩那型分別是我國南方和北方流行最廣的致病性鉤體。鉤體自然宿主動物也多達200余種，其中以豬、牛、狗等家畜以及黑線姬鼠、黃毛鼠、黃胸鼠等嚙齒類動物因其與人類關系密切或數量龐大而危害最大，可持續攜帶鉤體并從尿液排出鉤體，污染水源或土壤形成傳染源，人類接觸污染了鉤體的疫水/疫土而感染。鉤體感染人或動物時有如下特點：①能迅速穿越正?；蛴形⑿p傷的皮膚、黏膜迅速侵入宿主機體；②鼠類等宿主動物感染后往往無明顯癥狀，終身帶菌并從尿液排菌而成為傳染源；③人類感染后均發病，但臨床癥狀和體征輕重不一。鉤體病在臨床上可分六型，其中弱毒力的問號鉤體流感傷寒群感染引起的鉤體病僅呈流感傷寒樣輕癥過程，強毒力的問號鉤體黃疸出血群感染所引起的肺彌漫性出血型(pulmonary diffuse hemorrhage,PDH)死亡率可高達50％以上。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療，開展鉤端螺旋體宿主動物帶菌監測以及流行病學調查，研發一個省時、省力和特異性較高的致病性鉤端螺旋體檢測方法成為必要。

目前對于鉤端螺旋體的檢測主要依賴于傳統的增菌培養和顯微凝集試驗。該方法耗時大約5到7天，包括增菌，選擇培養及后續的顯微凝集試驗，其劣勢是耗時耗力，結果的判讀主觀性強，導致結果重復性差，易錯判。隨著核酸診斷技術的快速發展，一些以PCR為基礎的診斷技術(如普通PCR技術，熒光PCR技術)被用于致病性鉤端螺旋體的檢測，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續的電泳操作，昂貴的探針合成，以及熟練的操作人員，對于一些落后的實驗室無法進行，限制了這些技術的運用。目前運用這些檢測技術診斷致病性鉤端螺旋體的PCR方法和Real-time PCR方法，檢測靈敏度較差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。