[發明專利]一種檢測多環芳烴的類酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201811038023.6
• 申請日: 2018-09-06
• 公開（公告）號: CN109212187B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 趙曉祥;張璐璐;程晨;亢昕;張紫琴;馮璐
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/58;G01N30/74;G01N30/02
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所(普通合伙) 31233
• 代理人: 黃志達

本發明涉及一種檢測多環芳烴的類酶聯免疫試劑盒及其應用，包括一抗芳烴受體AhR、酶標二抗、多環芳烴PAHs標準品溶液、洗滌液、封閉液、顯色液、終止液。檢測方法包括：采用試劑盒檢測并通過標準曲線法確定檢測濃度。本發明可以對環境痕量PAHs進行檢測；檢測特異性強，操作簡便，靈敏度高，樣品用量少，可用于現場檢測。

技術領域

本發明屬于類酶聯檢測領域，特別涉及一種檢測多環芳烴的類酶聯免疫試劑盒及其應用。

背景技術

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)多環芳烴是指分子中含有兩個或者兩個以上苯環的，以線性、角狀和簇狀等方式連接而成的性質穩定的化合物。多環芳烴具有超過10000種單體，而其中已發現的400多種多環芳烴及其衍生物可以誘導人體產生癌癥。PAHs是一類惰性很強的化合物，在自然環境條件下降解緩慢甚至不分解，因此可以穩定存在并且不斷蓄積，可以持久的存在于環境中。同時多環芳烴具有半揮發性，可以以蒸汽形式、借助吸附于顆粒物來實現在大氣環境中進行遠距離的遷移，從而造成全球環境的極大污染。同時PAHs夠通過生物鏈的富集、皮膚接觸以及室內取暖等多種渠道進入體內，而PAHs的高脂溶性使其極易在生物體內，尤其是在脂肪中蓄積富集，進而可長期導致生物體產生不良或毒性反應。

酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應，同時利用酶催化作用的高效性，通過酶的催化作用于底物后的顯色反應判定結果，是目前應用最為廣泛的綜合性免疫學檢測技術。

Gomes和Samella以苯并[a]芘-6-異氰酸酯作為半抗原制備單克隆抗體,用于分析檢測尿液中的苯并[a]芘及其代謝物。張彥峰等以PBA為半抗原制備抗血清，在此基礎上建立了測定多環芳烴類物質的酶聯免疫測定方法，對10種PAHs與該抗血清的交叉反應進行了研究，結果表明芘和芘丁酸的半抑制濃度值分別為0.132mg/L和0.253mg/L，檢出限分別達到0.1mg/L和0.01mg/L。D.Knopp等以苯并[a]芘丁酸(BaPBA)的四類異構體分別作為半抗原用于制備相應的單克隆抗體,以1-苯并[a]芘丁酸為半抗原所建立的酶聯免疫方法對苯并[a]芘的檢出限達到0.3μg/L,與高效液相分析方法相比較，酶聯免疫對大氣顆粒物中的PAHs總量的測定結果呈現出較好的相關性。

目前檢測環境中多環芳烴的酶聯免疫法，需培養單克隆抗體或多克隆抗體，且檢驗單一多環芳烴。本發明方法涉及的AHR蛋白可在動物肝臟中提取，簡單易得，其次該方法可檢測環境中多環芳烴總量，為以后建立判定環境中多環芳烴類物質污染程度標準體系提供依據。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測多環芳烴的類酶聯免疫試劑盒及其應用，克服現有技術的多環芳烴的酶聯免疫法中，需要培養單克隆抗體或多克隆抗體，單克隆和多克隆抗體培養周期時間較長的技術，且檢測單一的缺陷，構建一種芳香烴受體與酶標蒽，即配體與受體反應的類酶聯免疫檢測方法，本發明中應用一種芳香烴受體蛋白，并建立與受體的免疫檢測方法，該受體與配體的結合特異性好，可以對水體痕量PAHs進行檢測；操作簡便，靈敏度高，樣品用量少，便于篩選樣品中是否PAHs，并且檢測環境中多環芳烴類物質的總量，為以后建立判定環境中多環芳烴類物質污染程度標準體系提供依據。

本發明的一種檢測多環芳烴的類酶聯免疫試劑盒，其特征在于，包括一抗芳烴受體AhR、酶標二抗、多環芳烴PAHs標準品溶液、洗滌液、封閉液、顯色液、終止液。

所述芳烴受體AhR為：取喂養于含多環芳烴PAHs水中的鯉魚的肝臟，清洗后吸干水分，然后加入HEDG緩沖液勻漿，離心取上清，得到粗提取的AhR，純化，得到芳烴受體AhR。

所述肝臟和HEDG緩沖液勻漿的比例為1g:4mL；HEDG緩沖液為25mmol·L^-1Hepes，1mmol·L^-1EDTA，1mmol·L^-1DTT，10％甘油，調pH7.5。