[發(fā)明專利]一種TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811035672.0
• 申請(qǐng)日: 2018-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN110878319A
• 公開（公告）日: 2020-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶麗;劉廣洛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海張江生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K14/705
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本發(fā)明提供了一種TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子的制備方法，該方法中所述的TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子（核因子κB受體活化因子配基receptor activator of NF?κB Ligand，RANKL）是增加了GST標(biāo)簽的融合蛋白，經(jīng)過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，在原核表達(dá)中RANKL所帶標(biāo)簽，該方法中的GST融合蛋白的標(biāo)簽無需另外添加特異性蛋白酶酶切，而是經(jīng)過GST融合蛋白自切去除。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地本發(fā)明涉及一種TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子的制備方法。

背景技術(shù)

TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子，TNF-related activation-induced cytokine（TRANCE），又名為細(xì)胞核因子κ B受體活化因子配體（Receptor Activator for NuclearFactor-κ B Ligand），osteoprotegerin ligand （OPGL），骨保護(hù)素配體 osteoclastdifferentiation factor（ODF ），破骨細(xì)胞分化因子。

TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子（核因子κB受體活化因子配基receptor activator ofNF-κB Ligand，RANKL）是一種Ⅱ型跨膜蛋白，是具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、發(fā)揮功能的因子。NF-κB受體激活體（receptor activator of NF-κB，RANK）是一種Ⅰ型跨膜蛋白，是RANKL的唯一受體，是RANKL發(fā)揮功能的關(guān)鍵。骨保護(hù)素是一種分泌型糖蛋白，與RANKL競爭性與RANK結(jié)合抑制骨吸收。許多激素、細(xì)胞因子、生長因子通過作用于核因子κB受體活化因子配體，骨保護(hù)素影響骨代謝，而導(dǎo)致骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松，溶骨性骨腫瘤及惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移等，RANKL過表達(dá)，可導(dǎo)致一系列骨疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎。

現(xiàn)有技術(shù)中RANKL生產(chǎn)的方式，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，但是采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RANKL會(huì)使用His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽等。標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測；二是構(gòu)成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。His是組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。

GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)，一個(gè)是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用。GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

GST融合蛋白純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。

針對(duì)GST融合蛋白中的GST標(biāo)簽的去除，采用位點(diǎn)特異性蛋白酶進(jìn)行切除，如凝血酶、Xa因子、PreScission蛋白酶等。為了去除GST標(biāo)簽而加入的特異性蛋白酶，為后續(xù)的純化有增加了負(fù)擔(dān)，同時(shí)也增加了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子的制備方法，該方法中的GST融合蛋白的GST標(biāo)簽是經(jīng)過GST融合蛋白自切而去除，不需要另外添加特異性蛋白酶酶切。