[發(fā)明專利]一種靶向性外泌體的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811032511.6
• 申請(qǐng)日: 2018-10-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109082404B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫坪;田云鵬;李柱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門艾賽生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C07K19/00;C12N15/70;A61K35/36;A61K35/22;A61P35/00
• 代理公司: 廈門加減專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35234
• 代理人: 陳文香

1.一種靶向性外泌體的制備方法，其特征在于：

將PSP1多肽與靶向肽或具有促進(jìn)免疫功能的短肽共價(jià)結(jié)合形成PSP1靶向肽后，再與外泌體進(jìn)行結(jié)合，即獲得具有靶向性外泌體；

PSP1靶向肽與外泌體進(jìn)行結(jié)合時(shí)，包括以下步驟：在外泌體中加入所述PSP1靶向肽進(jìn)行混合后，采用離心超濾，并用PBS進(jìn)行沖洗，即得到具有靶向性的外泌體；

所述靶向肽至少包括EGFR靶向肽、nAchR靶向肽和肝癌細(xì)胞靶向肽中的一種；

PSP1多肽的氨基酸序列為CLSYYPSYC。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性外泌體的制備方法，其特征在于：所述EGFR靶向肽為GE11多肽；

所述GE11多肽的氨基酸序列為：YHWYGYTPQNVI；

將所述PSP1多肽與所述GE11多肽進(jìn)行合成，得到PSP1-GE11靶向肽，所述PSP1-GE11靶向肽的氨基酸序列為：CLSYYPSYCYHWYGYTPQNVI。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向性外泌體的制備方法，其特征在于：所述nAchR靶向肽為嗜神經(jīng)性病毒衍生肽，其氨基酸序列為：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG；

將PSP1多肽、嗜神經(jīng)性病毒衍生肽和6個(gè)組氨酸殘基進(jìn)行合成，得到PSP1-RVG29-6His靶向肽；

所述PSP1-RVG29-6His多肽的氨基酸序列為：CLSYYPSYCYTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGHHHHHH。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向性外泌體的制備方法，其特征在于，PSP1-RVG29-6His靶向肽的合成的方法包括以下步驟：

步驟a、合成5’端和3’端各含有BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的DNA序列：5’-ggatccTGCCTGTCCTATTATCCGTCCTATTGCTACACTATTTGGA

TGCCGGAAAATCCGCGTCCGGGTACCCCATGCGACATCTTCACCAACTCCCGTGGTAAACGCGCGTCTAACGGCCACCATCACCACCACCATTAActcgag-3’；

步驟b、將步驟a中的DNA和pGEX-4T-1質(zhì)粒均采用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶，分別進(jìn)行雙酶切后分離純化；選取需要的目標(biāo)DNA條帶進(jìn)行切割，并分別提取PSP1-RVG29-6His DNA及pGEX-4T-1線性化質(zhì)粒；

步驟c、在酶切后提取的pGEX-4T-1線性化質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化處理；

步驟d、將酶切后提取的PSP1-RVG29-6His與去磷酸化后的pGEX-4T-1質(zhì)粒按照5:1的比例進(jìn)行混合后反應(yīng)；

步驟e、反應(yīng)后導(dǎo)入感受態(tài)E.coli K12，通過(guò)氨芐青霉素的篩選出陽(yáng)性菌落；

步驟f、將陽(yáng)性的表達(dá)菌落通過(guò)PSP1-RVG29-6His的IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)后收集，破碎收集到的細(xì)菌后離心，并收集上清液進(jìn)行純化后，即獲得GST/PSP1-RVG29-6His多肽；

步驟g、純化后的GST/PSP1-RVG29-6His多肽用凝血酶進(jìn)行GST 解離，而后通過(guò)分離獲得PSP1-RVG29-6His靶向肽。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向性外泌體的制備方法，其特征在于：步驟b中，采用BamHI和XhoI限制性在37°C下進(jìn)行雙酶切4h，并采用瓊脂糖凝膠電泳分離純化。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向性外泌體的制備方法，其特征在于：步驟c中的去磷酸化處理過(guò)程為：

酶切后的pGEX-4T-1線性質(zhì)粒溶液中加入CIAP和10×CIAP 緩沖劑，并用DDW 補(bǔ)齊至20μL，于37°C 下反應(yīng)30min后，經(jīng)DNA純化。