[發明專利]使用短短芽孢桿菌分泌表達超敏蛋白的方法

在審

• 申請號: 201811031684.6
• 申請日: 2018-09-05
• 公開（公告）號: CN109134626A
• 公開（公告）日: 2019-01-04
• 發明（設計）人: 劉勝
• 申請（專利權）人: 劉勝
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/75
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 唐寧

本發明涉及一種使用短短芽孢桿菌分泌表達超敏蛋白的方法，所述的方法包括如下步驟，(1)將超敏蛋白的編碼基因插入到以短短芽孢桿菌為宿主的質粒中，(2)將插入了所述超敏蛋白的質粒轉入短短芽孢桿菌宿主中，(3)發酵培養所述短短芽孢桿菌，(4)分離提取所述超敏蛋白。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，涉及一種使用短短芽孢桿菌分泌表達超敏蛋白的方法。

背景技術

化肥和農藥是提高作物產量和防治病蟲害的主選產品，但同時產生了環境、能源以及成本等方面的問題，成為現在困擾世界各國的經濟與社會發展的重大，嚴重制約著農業的可持續性發展。而利用來自微生物或真菌的蛋白質制備的生物制品(包括生物肥料和生物農藥)是當代作物優質、高效和無公害生產的主要措施。近年來，國內外在此方面已開展了大量的科學研究。早期的微生物蛋白主要是來自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白(ICP),新型微生物蛋白主要是蛋白激發子類物質，目前研究報道的具有代表性的新型微生物蛋白主要有過敏蛋白(Harpin)、隱地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)，這些蛋白質不直接殺滅害蟲和病原物，也不直接提供營養物質，而是在促進植物生長發育和對營養物質的吸收、增強植物的廣譜抗病性(包括對多種細菌、真菌和病毒的抗性)、增強植物的驅蟲性、增強植物的抗逆性(植物對干旱、嚴寒、鹽堿等不良環境的耐受性)、延長作物產品的儲存時間、對盆花和苗木的塑形作用方面有廣泛應用前景。因此，它們可以配制成生物制品，應用到以上方面。

這些新型微生物蛋白或多肽大都通過發酵重組大腸桿菌等生物工程菌來實現大批量生產，在發酵后的下一步工藝為溶解細菌懸浮液中的細菌細胞以釋放微生物蛋白或多肽。細胞溶解的方法有非化學的方法，如高壓或超聲波處理，使用該方法對設備要求較高，能耗高且難以大規模應用。作為另外的選擇，大部分廠商采用將細胞懸浮液與溶菌酶接觸來進行，之后還需要進行40-42℃消化，離心去細胞碎片和變性蛋白，以及蛋白純化工藝以達到需要的純度。這些工藝操作復雜，成本昂貴，且由于步驟多，過程冗長，會降低微生物蛋白和多肽的收率，并降低它們的生物活性和穩定性。

因此，需要有步驟簡便、成本低廉的方法用于這類新型微生物蛋白或多肽的生產。

發明內容

為了解決上述問題，提供一種簡便、快速的超敏蛋白的制備方法，本發明提供如下技術方案。

本發明首先涉及一種使用短短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)作為宿主菌，發酵培養生產目的蛋白的方法，所述的方法包括如下步驟，

(1)將所述目的蛋白的編碼基因插入到以短短芽孢桿菌為宿主的質粒中，

(2)將插入了所述目的蛋白的質粒轉入短短芽孢桿菌宿主中，

(3)發酵培養所述短短芽孢桿菌，

(4)分離提取所述目的蛋白。

步驟(1)所述的目的蛋白為超敏蛋白、優選為來源于菌株Erwinia amylovora的GeneBank編號為M92994.3的harpinEa蛋白；

步驟(1)所述的質粒為pNC-hisT質粒；

步驟(2)所述的將質粒轉入短短芽孢桿菌宿主中的方法為電擊轉化方法；

步驟(3)所述的發酵培養的培養條件為：T2培養基、溫度30～33℃、轉速120～200rpm、發酵培養時間24～60h，優選的，發酵培養條件是：T2培養基、溫度33℃、轉速120rpm、發酵培養時間48h；

步驟(4)所述的分離提取所述目的蛋白的步驟是：收集發酵后的菌液，離心收集上清，對上清液進行切向流超濾及濃縮，獲得目的蛋白超濾濃縮液。

所述的切向流超濾的步驟是：