[發明專利]一種微量DNA樣品高通量測序文庫的構建技術

有效

• 申請號: 201811025369.2
• 申請日: 2018-09-04
• 公開（公告）號: CN109023537B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 趙小東;康亞妮;胡叢霞;徐偉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發明提供了一種微量DNA樣品高通量測序文庫的構建技術。具體地，本發明方法包括步驟：(a)提供DNA片段和輔助核酸片段；(b)向DNA片段和輔助核酸片段兩端添加接頭；(c)用特異性抗體捕獲、富集末端帶有接頭的DNA片段和輔助核酸片段；(d)用特異性酶去除所述輔助核酸片段；(e)用特異性引物對所述步驟(c)中捕獲、富集的DNA片段和輔助核酸片段進行擴增，從而獲得擴增產物。本發明方法更適用于少量來源的微量樣品的文庫構建；文庫質量好，無污染；成本較低，具有較高的普遍適用性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種微量DNA樣品高通量測序文庫的構建技術。

背景技術

隨著生命科學技術的不斷革新，人們對于生命科學的研究也越來越深入，從生命現象到內在機理再到遺傳物質，而對于遺傳物質的研究也逐漸從空間上的一維延伸到二維再到三維結構。核酸是生命遺傳信息的載體，而核酸通常又是以很多種復雜的形態結構存在著。要揭開生命科學的神秘面紗，基因組學研究以及表觀遺傳學研究勢在必行。第二代測序技術的出現，大大降低了測序成本，還大幅度提高了測序速度并保持了高準確性。在第二代測序技術不斷完善的同時，第三代測序技術也初現端倪。然而，由于其中關鍵技術問題尚待解決，目前應用受到限制。

測序文庫是含有某種生物體全部基因組DNA或者存在共性的DNA群體的隨機片段的DNA克隆群，是進行全基因組測序、構建物理圖譜、染色體步移、表觀遺傳修飾等研究的基礎，為基因組學以及表觀遺傳學研究提供了強有力的技術平臺。近年來，包括人、擬南芥、水稻等越來越多的基因組被測序，全基因組測序為重要的基因克隆、基因的系統進化以及基因組學研究提供了堅實的平臺。但是對于一些特殊樣本，獲取難度大、基因組提取量少(低于50ng)，按照目前的建庫流程和方法，無法獲得可以用于高通量測序的文庫。

測序文庫質量的高低決定了測序文庫作用的大小。然而，當其實樣品量較少時，由于分子碰撞幾率降低，連接反應和擴增反應難度都會大大增加，并且雜質的影響被放大，文庫常常很難構建成功。

目前，針對低起始量DNA建庫的方法主要有轉座酶法和普通流程建庫。而轉座酶切割打斷建庫的方法易受樣本質量的影響，導致切割失敗，基因組無法正常片段化，在后續擴增中無法得到有效擴增。而普通流程建庫無法進行低于20ng的建庫，在起始量在50ng時，建庫成功率僅為30％，且文庫質量較差。

因此，本領域急需一種專門針對微量DNA樣品通用型的高通量測序文庫構建方法。

發明內容

本發明的目的就是提供一種微量DNA樣品高通量測序文庫的構建技術。

在本發明的第一方面，提供了一種微量DNA樣品高通量測序文庫的構建方法，包括步驟：

(a)提供第一混合物，所述第一混合物包括DNA片段和輔助核酸片段，所述DNA片段包括來源于細胞基因組DNA；

(b)向所述第一混合物中的DNA片段和輔助核酸片段兩端添加接頭，從而得到含末端帶有接頭的DNA片段和輔助核酸片段的第二混合物；

(c)用特異性抗體捕獲富集所述的第二混合物中的末端帶有接頭的DNA片段和輔助核酸片段；

(d)任選地用特異性酶去除所述輔助核酸片段；

(e)用特異性引物對上一步驟中經捕獲富集的DNA片段和輔助核酸片段進行擴增，從而獲得含擴增產物的第三混合物；和

(f)任選地，用特異性針對所述輔助核酸片段的核酸酶對所述第三混合物進行處理，從而消化所述輔助核酸片段，從而獲得含有富集所述DNA片段的擴增產物的第四混合物。

在另一優選例中，所述方法還包括：(g)對上一步驟中富集的所述DNA片段的擴增產物進行建庫，從而獲得所述測序文庫。

在另一優選例中，所述的DNA片段是經片段化處理形成的DNA片段。