[發明專利]核酸酶介導的使用大靶向載體的靶向

有效

• 申請號: 201811024942.8
• 申請日: 2013-04-25
• 公開（公告）號: CN109536526B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: D·弗倫德維;W·奧爾巴克;D·M·瓦倫澤拉;G·D·揚科普洛斯;K·V·萊
• 申請（專利權）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12
• 代理公司: 北京市君合律師事務所 11517
• 代理人: 趙昊;孫倩

1.一種通過在小鼠胚胎干(ES)細胞中進行同源重組以修飾基因組的靶基因座的方法，所述方法包括：

(a)向所述小鼠ES細胞中引入：

(i)鋅指核酸酶(ZFN)，所述鋅指核酸酶在基因組的靶基因座或其附近產生單鏈或雙鏈斷裂，和

(ii)大靶向載體(LTVEC)，所述大靶向載體包含翼側為上游同源臂和下游同源臂的插入核酸；其中所述插入核酸的長度范圍為5kb至30kb，并且所述上游同源臂和所述下游同源臂的總和是至少10kb；

(b)檢測所述小鼠ES細胞中所述插入核酸整合進入所述基因組的靶基因座的情況，其中所述整合使得在所述靶基因組的基因座處內源性核酸序列缺失并被所述插入核酸取代；以及

(c)選擇經靶向的小鼠ES細胞，所述小鼠ES細胞包含在所述基因組的靶基因座中的所述插入核酸，其中與單獨使用LTVEC相比，將所述LTVEC與所述ZFN聯合使用使得靶向效率增加。

2.根據權利要求1所述的方法，其中與單獨使用LTVEC相比，所述LTVEC的靶向效率增加至少2倍。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述ZFN是表達構建體，所述表達構建體包含編碼ZFN蛋白的核酸序列，并且其中所述核酸與在小鼠細胞中有活性的啟動子可操作地連接。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述ZFN是編碼ZFN蛋白的mRNA。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述ZFN的靶序列位于所述基因組的靶基因座的內含子、外顯子、啟動子或增強子區中。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含選擇性表達盒。

7.根據權利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含報告基因。

8.根據權利要求1所述的方法，其中將所述插入核酸整合進入所述基因組的靶基因座使得在所述基因組的靶基因座缺失內源性基因。

9.根據權利要求1所述的方法，其中將所述插入核酸整合進入所述基因組的靶基因座導致敲除、敲入、點突變、結構域交換、外顯子交換、內含子交換、調節序列交換、基因交換或其組合。

10.根據權利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含人源核酸序列。

11.根據權利要求1所述的方法，其中檢測步驟(b)通過等位基因修飾(MOA)檢測實施。

12.根據權利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含與在所述基因組的靶基因座處的被取代的核酸序列具有同源性的核酸序列。

13.根據權利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含與在所述基因組的靶基因座處的被取代的核酸序列具有直系同源性的核酸序列。

14.根據權利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含來自非小鼠的種屬的核酸序列。

15.根據權利要求1所述的方法，其中所述LTVEC的長度范圍為50kb至300kb。

16.根據權利要求15所述的方法，其中所述LTVEC的長度范圍為50kb至100kb。

17.根據權利要求15所述的方法，其中所述LTVEC的長度范圍為100kb至200kb。

18.根據權利要求15所述的方法，其中所述LTVEC的長度范圍為200kb至300kb。

19.根據權利要求1所述的方法，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂的總和的范圍為10kb至100kb。