[發明專利]半滑舌鰨外泌體piR-mmu-31018127應用

有效

• 申請號: 201811020132.5
• 申請日: 2018-09-03
• 公開（公告）號: CN108998545B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 張博;趙娜;賈磊;車金遠;高磊;李仰真;鮑寶龍;劉克奉
• 申請（專利權）人: 天津渤海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種半滑舌鰨piR?mmu?31018127的應用，所述性別標簽piR?mmu?31018127來源于魚精漿外泌體，本發明通過small RNA測序分析，篩選到兩種魚顯著差異表達的標簽piRNAs作為候選，通過實時定量PCR驗證，最終確定了對兩種魚具有指示作用的piRNA生物標志物，標簽piRNAs為piR?mmu?31018127，序列為GCATGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCG，并以此為基礎開發制備了檢測試劑盒。本發明方法具有無創，高效的優點，且鑒定結果可靠，是首次通過定量檢測來判別半滑舌鰨的遺傳性別。

技術領域

本發明屬于魚類生物技術領域，特別是涉及一種半滑舌鰨性別標簽piR-mmu-31018127作為性別標簽的應用。

背景技術

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)由于雌、雄魚生長速度和體型的巨大差異，以及養殖中雄魚比例高，經濟價值低的問題，產業發展受到一定程度的制約。研究發現雄魚中有很大比例的偽雄魚，即遺傳上是雌魚，但表型上是雄魚。而用偽雄魚作為父本，后代也會遺傳父親的特征成為偽雄魚，導致了雄魚比例高的問題。因此鑒別偽雄魚對于半滑舌鰨育種產業具有重要的意義。傳統的雌性特異微衛星分子標記法需要瓊脂糖電泳條帶識別，具有一定的誤差；而染色體鑒定準確性受制片效果的制約，這兩種方法都是定性的判斷。本發明開發了半滑舌鰨精漿外泌體piRNAs標志物，應用定量PCR的方法定量考察piRNA的表達量以實現鑒別半滑舌鰨雄魚及偽雄魚，具有準確性高、結果穩定可靠的優勢。

主要存在于動物生殖系統的piRNA(Piwi-interactiing RNA)是一類長度約為26-32nt(nucleotides)的非編碼RNA。piRNA在動物發育和生殖調控中起重要作用,在果蠅卵巢生殖細胞中,經PIWI家族蛋白的協同、加工,piRNA經過乒乓循環(“Ping-Pong”cycle)在細胞中的大量擴增,其具體作用機制還有待發掘。在海洋動物中外泌體來源的piRNAs作為生物標志物的研究幾乎沒有報道，本發明開發了的一種半滑舌鰨精漿外泌體piRNAs標志物，解決了半滑舌鰨雄魚及偽雄魚遺傳性別的識別問題，具有創新性。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供一種半滑舌鰨piR-mmu-31018127的應用，所述的piR-mmu-31018127來源于半滑舌鰨的精漿外泌體piRNA，所述應用為作為性別標簽,以解決半滑舌鰨雄魚及偽雄魚遺傳性別的區分問題。在海洋動物中外泌體來源的piRNA作為生物標志物的研究幾乎沒有報道，本發明開發了針對以半滑舌鰨為代表的魚精漿來源的外泌體提取及初步應用的方法，解決了半滑舌鰨雄魚及偽雄魚遺傳性別的識別問題。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：

一種半滑舌鰨性別標簽piR-mmu-31018127的應用，所述的性別標簽piR-mmu-31018127來源于半滑舌鰨的精漿外泌體piRNA，序列為GCATGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCG。

本發明還提供一種所述精漿外泌體piR-mmu-31018127的篩選方法，具體步驟如下：

1)精漿外泌體分離鑒定后，對精漿外泌體smallRNA進行測序分析，Small RNA種類繁多，將clean reads依次和Rfam數據庫、cDNA序列、物種重復序列庫、piRBase數據庫進行比對，以對測序結果中的smallRNA進行分類注釋；將注釋后的序列和piRBase數據庫比對，進行已知piRNA的統計；使用未注釋上的序列進行新的piRNA預測，piRNA差異表達分析，差異表達piRNA靶基因的通路富集分析和功能富集分析，最后與雄魚、偽雄魚樣品進行相關性匹配，篩選出一種或者多種對雄魚和偽雄魚兩種樣品具有指示作用的piRNA作為候選的生物標記物；