[發明專利]一種胰腺癌標記物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811000436.5
• 申請日: 2018-08-30
• 公開（公告）號: CN108929914A
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發明（設計）人: 肖明兵;金丹丹;吳紅培;江楓;倪潤洲;錢坤艷;陸翠華;倪溫慨;曹建中
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6837;C12N15/113
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁金娟

1.一種胰腺癌標記物，其特征在于，包括以下在血清/血漿中穩定存在且可檢測的微小核糖核酸成熟體中的兩種或兩種以上：miR-212、miR-21、miR-193b、miR-200c和miR-181d；其中，

所述miR-212為hsa-miR-212-5p，其序列為：ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACU；

所述miR-21為hsa-miR-21-5p，其序列為：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；

所述miR-193b為hsa-miR-193-5p，其序列為：CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA；

所述miR-200c為hsa-miR-200c-5p，其序列為：CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG；

所述miR-181d為hsa-miR-181d-5p，其序列為：AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGG。

2.一種用于根據權利要求1所述的一種胰腺癌標記物的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、制備基因芯片，所述基因芯片均包括固相載體及固定于固相載體上的待測樣品，所述固相載體采用醛基化的載玻片；

所述基因芯片上分為質控部分和標記物檢測部分，所述質控部分包括陰性對照和陽性對照；其中，陰性對照包括空白組、點樣液組、擬南芥組，陽性對照包括內參U6、酵母基因序列1、酵母基因序列2；所述標記物檢測部分包括hsa-miR-212-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-200c-5p和hsa-miR-181d-5p的Oligo探針；

S2、抽提待測樣品的胰腺癌標記物基因miRNA：miR-212、miR-21、miR-193b、miR-200c和miR-181d中的兩種或兩種以上；

S3、將S2步驟中提取的血清/血漿中的miRNA，進行逆轉錄及擴增，然后進行熒光標記；

S4、基因芯片雜交；

S5、基因芯片洗滌；

S6、結果分析：掃描儀掃描芯片，檢測雜交反應的結果。

3.根據權利要求2所述的一種胰腺癌標記物的檢測方法，其特征在于，所述步驟S1中醛基化的載玻片具體制備方法包括以下步驟：

a、采用載玻片為基片，清洗基片，于搖床上60 rpm搖動2 h，清洗溶液為水、乙醇、NaOH；

b、取出玻片，用ddH2O沖洗3 min，共4次，并用N2吹干；

c、將玻片在Piranha溶液中浸泡30 min，使玻片表明羥基化，重復步驟b；其中，所述Piranha溶液中包括濃度為98%的H2SO4 及濃度為30%的H2O2，且兩者用量之比為7 ：3；

d、 將玻片浸入在用無水乙醇配置的10 mM的APTES中30 min，于搖床上用無水乙醇60rpm清洗 1 h，用N2吹干；其中，所述APTES為3-乙氨基-三乙氧基硅烷；

e、在100-110℃的烘箱中烘烤1 h，使APTES與玻片完全結合；

f、浸泡在10 mM的對苯二甲醛的丙酮溶液中30 min，重復步驟2，室溫下避光保存。

4.根據權利要求2所述的一種胰腺癌標記物的檢測方法，其特征在于，所述步驟S2中miRNA的提取方法包括以下步驟：取10 ml血液樣本加1 ml TRIZOl，冰上靜置10 min，試劑為Invitrogen TRIzol；200 ul氯仿震蕩15 s，4℃靜置2 min，12000 g/15 min，小心吸取中間層約500 ul；500 ul異丙醇混合均勻，4℃靜置10 min，12000 g/15 min；1 ml 75%乙醇輕輕洗滌，7500 g/5 min，2次；55-65℃烘干，20-30 ul DEPC水溶解，65℃促溶；比色，A260/A280在1.8~2.0之間，取500 ng樣本進行瓊脂糖凝膠電泳驗證產物抽提質量。