[發明專利]一種鳥苷四磷酸的超高效液相色譜檢測方法

在審

• 申請號: 201810994060.8
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN109932439A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 羅來鑫;白凱紅;蔣娜;李健強;曹永松
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發明公開了屬于化學分析技術領域的一種鳥苷四磷酸的超高效液相色譜檢測方法。所述方法包括，采用如下色譜條件：色譜柱：反相C18色譜柱；流動相：包括流動相A與流動相B；所述流動相A為甲醇或乙腈，所述流動相B為KH₂PO₄溶液或K₂HPO₄?KH₂PO₄緩沖液；洗脫條件為：流動相A：流動相B＝3～10：97～90。本發明的方法能有效檢測到ppGpp，基線平穩，進樣量少，節約時間和成本，不需設置梯度洗脫，操作簡單方便，檢測效果好。

技術領域

本發明涉及化學分析技術領域，具體涉及一種鳥苷四磷酸的超高效液相色譜檢測方法。

背景技術

鳥苷四磷酸(ppGpp，C₁₀H₁₇N₅O₁₇P₄)分子量為603，是一種小分子核苷酸，1969年首次被報道，是細菌應對脅迫的一種重要的警衛素。大腸桿菌(Escherichia coli)處于氨基酸缺乏的環境時，體內核苷酸會發生變化，通過薄層層析技術可觀察到“魔斑1”與“魔斑2”的出現，后證實分別為ppGpp與鳥苷五磷酸(pppGpp)。當細菌遇到環境脅迫時，菌體內積累(p)ppGpp，從而觸發嚴緊反應，使得與脅迫相關的基因上調表達。在細菌菌體內，pppGpp穩定性差，可通過pppGpp磷酸水解酶(GppA)和GTP酶的催化能快速轉化為ppGpp，因此本發明方法主要研究ppGpp的檢測。

目前對于ppGpp的檢測方法常用的為高效液相色譜法?，F有文獻(Ochi,Kandalaet al.1981)報道中常用高低鹽溶液緩沖液進行梯度洗脫的高效液相色譜(HPLC)方法進行ppGpp的檢測，具體方法為：選用陰離子交換色譜柱(Partisil SAX 10,4.6×250mm,Whatman)；Buffer A為低鹽緩沖液：7mmol/L KH₂PO₄溶液，H₃PO₄調節pH至4.0；Buffer B為高鹽緩沖液：0.5mol/L KH₂PO₄與Na₂SO₄溶液，KOH調節pH至5.0；洗脫條件為Buffer B在20min內從0％(v/v)升到100％(v/v)，然后100％維持20min，最后5min從100％降到0％；流速為1mL/min；進樣量為90μL。上述檢測方法存在的缺點是：基線漂移，積分不準確；且緩沖液均為鹽溶液，易損傷色譜柱與儀器；出峰時間為45min，耗時長；需設置梯度洗脫，操作復雜。

超高效液相色譜儀簡稱UHPLC，超高效液相色譜是分離科學中的一個全新類別，UHPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統體積及快速檢測手段等全新技術。目前尚未有利用UHPLC檢測ppGpp方法的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的問題，為了提高鳥苷四磷酸的檢出率、積分的準確性；節約成本、簡化操作，提供一種需時較短、分離效果更好、積分更準確、更簡便的鳥苷四磷酸的超高效液相色譜檢測方法。

為此，本發明的技術方案為：

一種鳥苷四磷酸的超高效液相色譜檢測方法，包括如下步驟，采用如下色譜條件：

色譜柱：反相C18色譜柱；

流動相：包括流動相A與流動相B；

所述流動相A為甲醇或乙腈，所述流動相B為KH₂PO₄溶液或K₂HPO₄-KH₂PO₄緩沖液；

洗脫條件為：流動相A：流動相B＝3-10：90-97。