[發(fā)明專利]一種“人源性”短QT綜合征疾病模型的建立方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810993321.4
• 申請日: 2018-08-29
• 公開（公告）號: CN109266681A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁平;蔣晨陽;果馮馮;孫雅遜;宮庭鈺
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發(fā)明公開了一種“人源性”短QT綜合征疾病模型的建立方法，具體為應(yīng)用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術(shù)建立“人源性”短QT綜合征(Short QT syndrome，SQTs)疾病模型的方法。將來自患有SQTs疾病個(gè)體的病人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，再將其定向分化為SQTs病人特異性的心肌細(xì)胞，以建立一個(gè)穩(wěn)定的體外心肌細(xì)胞疾病模型，并將其用于分析疾病機(jī)制、篩選治療藥物，同時(shí)應(yīng)用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對病人致病基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)校正，再將校正完成的iPSCs分化為心肌細(xì)胞，并對其各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測，為研究疾病的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及到應(yīng)用體細(xì)胞重編程技術(shù)建立病人特異性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株以及應(yīng)用心肌定向分化技術(shù)獲得病人特異性的心肌細(xì)胞，建立“人源性”短QT 綜合征疾病模型，以及CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，已經(jīng)有很多遺傳性心血管疾病被報(bào)道并被闡述機(jī)理，這其中包括如肥厚型心肌病類結(jié)構(gòu)異常的心血管疾病，以及并沒有明顯的結(jié)構(gòu)改變但會導(dǎo)致突發(fā)性心源性猝死的疾病。長QT間期綜合征(Long QT Syndrome,LQTs)是最為大眾所熟悉的心臟離子通道病，其在心肌細(xì)胞中主要導(dǎo)致鉀離子和鈉離子通道的異常，但其并不會產(chǎn)生明顯的心臟結(jié)構(gòu)病變。最近，人們對此類可能帶來嚴(yán)重預(yù)后的心臟離子通道病越來越感興趣，但其在心電圖上的反應(yīng)卻和預(yù)期并不相同。短QT綜合征(Short QT syndrome，SQTs)是一種罕見的，異源性基因遺傳的心臟離子通道病，其以心電圖QT間期、心室以及心房不應(yīng)期的縮短為最主要特征，同時(shí)存在SCD和惡性心律失常(如心房顫動(dòng)、室性心動(dòng)過速)等病變。

有報(bào)道指出，約有80％的SQTs病人在睡眠時(shí)發(fā)生心源性猝死(SCD)，而部分治愈后的病人仍有較大的可能性發(fā)生快速型心律失常。所以在過去的幾十年中，仍是采用植入型心臟除顫器(ICD)作為SQTs的主要治療方式。

在分子水平上，常使用心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位代表心電圖上的QT間期。動(dòng)作電位幅值的大小與心臟的跳動(dòng)頻率密切相關(guān)，因此在使用動(dòng)作電位作為衡量QT 間期的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，得到校正后的QT間期(QTc)。2015年最新發(fā)布的歐洲心臟病學(xué)會指南指出，正常男性和女性的QTc時(shí)長分別為480ms 和360ms。如果QTc≤340ms則認(rèn)為有較高的風(fēng)險(xiǎn)患有SQTs。同時(shí)，當(dāng)病人的 QTc≤360ms且同時(shí)含有以下一個(gè)或多個(gè)指征時(shí)，也被認(rèn)為有較高的風(fēng)險(xiǎn)患有 SQTs：(1)病人被確認(rèn)有致病基因突變；(2)家族中有人患有SQTs；(3)整個(gè)家族有40年左右的SQTs家族史；(4)有SCD發(fā)生經(jīng)歷。此外，SQTs病人可能無明顯臨床癥狀或有過心悸以及因房顫引起的眩暈。已經(jīng)有部分研究者推薦對在校青少年進(jìn)行ECG檢測以篩查疾病，此外，當(dāng)病人被確診后，應(yīng)當(dāng)對其所有家庭成員均進(jìn)行臨床患病評估。

遺傳以及成年后的某些因素均有可能會引起SQTs。2000年，第1例家族性 SQTs被報(bào)道。之后，更多的SQTs病人陸續(xù)被報(bào)道。截至到目前，已有6種SQTs 的亞型被發(fā)現(xiàn)。SQTs 1型、2型和3型是與鉀離子通道的功能改變有關(guān)，而SQTs 4型、5型和6型則與鈣離子通道功能缺失有關(guān)。KCNH2基因是首先被確定的致病基因突變位點(diǎn)，其編碼的電壓激活型鉀離子通道的孔區(qū)亞基屬于hERG(human ether-a-go-go)家族，其在整個(gè)心臟的動(dòng)作電位過程中主要影響快速延遲整流的鉀電流(Ikr)。研究表明，共有3種基因編碼鉀離子通道，KCNH2與SQTs1型有關(guān)，KCNQ1與SQTs 2型有關(guān)，KCNJ2與SQTs 3型有關(guān)，而編碼鈣離子通道的3種基因：CACN1AC、CACNB2和CACNA2D1則分別與SQTs 4型、5型和 6型有關(guān)。然而，在高達(dá)40％的SQTs病例中，基因分析并不能很準(zhǔn)確的確定疾病的遺傳信息。此外，SQTs病人同時(shí)患有Brugada綜合征的這種重疊患有遺傳疾病的現(xiàn)象也已經(jīng)被報(bào)道過?；加蝎@得性SQTs的主要原因是電解質(zhì)失衡，包括高鉀血癥或高鈣血癥、心肌缺血、酸中毒或肉堿缺乏癥。體溫過高有時(shí)也會導(dǎo)致 QT間期的縮短。同時(shí)，如洋地黃、乙酰膽堿等藥物，以及ATP敏感的鉀離子通道激活劑也有可能導(dǎo)致QT間期的縮短。