[發明專利]一種鑒別棕鱒和亞東鮭的分子生物學方法

在審

• 申請號: 201810990358.1
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN109055516A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 楊天燕;孟瑋;高天翔
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/70;C12Q1/6888
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

本發明公開了一種鑒別棕鱒和亞東鮭的分子生物學方法，包括如下步驟：1)采用改良酚?氯仿法分別提取棕鱒和亞東鮭組織的基因組DNA；2)設計ITS1序列的引物；3)以兩種魚的DNA為模板，進行PCR擴增；4)PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收后與pMD18?T載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α，對每個個體挑取單克隆進行菌液測序；5)序列比對。有益效果為：本發明分子生物學方法科學有效、簡單快捷、準確可行，特異性強、可信度高，不用處死棕鱒和亞東鮭，能夠一次性對兩種物種同時進行擴增，具有高效快速和便捷的優點。

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，尤其是涉及一種鑒別棕鱒和亞東鮭的分子生物學方法。

技術背景

棕鱒(Salmo trutta fraio Linnaeus)又名河鱒、河鮭等，隸屬于鮭科、鮭亞科、鮭屬，原產于歐洲、非洲北部和中亞一些地區，屬于冷水性經濟魚類，具有較高的經濟價值和營養價值。19世紀由英國人從歐洲引種移植后，目前我國僅棲息于西藏日喀則地區亞東縣海拔約3000m的亞東河，為我國西藏高海拔地區的重要珍稀經濟魚類，1992年被西藏自治區列為二級水生保護動物。新疆維吾爾自治區具有豐富的冷水資源，為了充分利用豐富冷水資源，培育優質冷水魚新品種，新疆有關科研院所2009年從西藏亞東地區引進少量亞東鮭進行試驗性養殖，此后2011年起又連續多年從巴基斯坦引進棕鱒發眼卵進行孵化和養殖試驗，并獲得了成功。

有研究認為亞東鮭為棕鱒的同物異名，也有認為亞東鮭是棕鱒的一個亞種，二者僅從外部形態上幾乎難以分辨。準確的物種鑒定是開展人工繁殖的前提和基礎，為了準確、快速對二者進行鑒別，防止養殖過程中親本和魚苗的混雜，有必要進行相關技術的研發。核糖體DNA轉錄間隔區1(internal transcribed spacer，ITS1)在進化過程中表現出高度的保守性，成為研究生命起源和早期生物進化高級階元系統發育的最主要的分子標記，是介于5.8S rDNA和28S rDNA基因之間的一段非編碼區序列，由于承受的選擇壓力較小、相對變化較大，適合物種及種群水平的系統發生研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種科學有效、簡單快捷、準確可行，特異性強、可信度高，不用處死棕鱒和亞東鮭，能夠一次性對兩種物種同時進行擴增，具有高效快速和便捷的優點的鑒別棕鱒和亞東鮭的分子生物學方法。

本發明針對背景技術中提到的問題，采取的技術方案為：

一種鑒別棕鱒和亞東鮭的分子生物學方法，其特征在于：包括如下步驟：

采用改良酚-氯仿法分別提取棕鱒和亞東鮭組織的基因組DNA；

設計ITS1序列的引物；

以兩種魚的DNA為模板，進行PCR擴增；

PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用天根回收試劑盒純化回收后與pMD18-T載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α，對每個個體挑取單克隆進行菌液測序，由于前面測序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段濃度較低達不到測序要求，因此需要對PCR片段進行克隆擴增；

序列比對。ITS1基因在進化過程中表現出高度的保守性，由于承受的選擇壓力較小、相對變化較大，適合物種及種群水平的系統發生研究，本發明通過分子克隆技術，通過選擇ITS1基因、擴增并測序比對了兩種魚類ITS1序列，查明變異位點差異來鑒別棕鱒和亞東鮭，為二者提供了一種科學有效、簡單快捷、準確可行的分子生物學鑒定方法，具有特異性強、可信度高的優勢，同時也為其種質資源保護和開發利用提供保障。