[發(fā)明專利]抗地克珠利單克隆抗體可變區(qū)序列及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810989101.4
• 申請日: 2018-08-28
• 公開（公告）號: CN109384847B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈泓;李超;陳萬勤;羅金文;王知堅;孫晗;楊曉潔;匡榮;陳碧蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N15/13
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

一種抗地克珠利單克隆抗體可變區(qū)序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為3D6 2E4?VH和3D6 2E4?VL。用地克珠利蛋白偶聯(lián)物作為抗原，免疫小鼠后，檢測得到相應(yīng)抗體表達呈陽性的小鼠，分離其脾細(xì)胞后，融合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測得到抗體表達陽性克隆，提取陽性雜交瘤細(xì)胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)抗體基因的cDNA，再用特異引物PCR獲得相應(yīng)抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并進行克隆和測序。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗體制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗地克珠利單克隆抗體可變區(qū)序列及其制備方法。

背景技術(shù)

在集約化的養(yǎng)殖模式中，球蟲是最常見的流行暴發(fā)性寄生蟲疾病，具有高度的易感性，而且死亡率較高，一旦發(fā)生往往對養(yǎng)殖者造成極嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。球蟲作為一種寄生蟲，使用疫苗進行免疫難以產(chǎn)生良好的免疫效果，而且代價昂貴，所以長期藥物預(yù)防一直是畜禽球蟲病防治的唯一可靠手段。地克珠利(Diclazuril)屬三嗪苯乙腈化合物，是上世紀(jì)八十年代由揚森公司開發(fā)研制的非聚醚類化學(xué)合成抗球蟲藥，具有高效、低毒、廣譜的特點，能有效降低養(yǎng)禽業(yè)因球蟲感染帶來的經(jīng)濟損失，在養(yǎng)殖業(yè)中也廣泛用于球蟲病的防制。地克珠利幾乎不溶于水，微溶于乙醇、乙醚，溶于N，N-2甲基甲酰胺(DMF)、二甲基來砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)。

食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)和歐盟藥品管理局(European MedicinesAgency)都對地克珠利毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)進行了評估，并推薦了日允許攝入量(AcceptableDaily Intakes)和最高殘留限量(MRLs)。農(nóng)業(yè)部第2002-235號公告也對地克珠利的MRLs進行了規(guī)定。根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部制定地克珠利在雞的肌肉、皮膚和脂肪、肝臟、腎臟各組織中的最高殘留限量分別為500ppb、1000ppb、3000ppb、2000ppb。一日攝取容許量(ADI)為0-30μg/人/天。

如何對樣品中殘留的檢測顯得尤為重要,有免疫檢測的可以進行檢測,但是靈明度不夠高,這需要建立高靈敏低成本的免疫檢測方法，而具達到有高靈敏度的免疫檢測方法主要依靠高親和力的抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決上述問題而提供制備抗地克珠利抗體的可變區(qū)核苷酸序列的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明的目的是構(gòu)建抗地克珠利單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，同上提供制備上述核苷酸序列的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明用地克珠利蛋白偶聯(lián)物作為抗原來免疫小鼠，然后檢測出相應(yīng)抗體表達呈陽性的小鼠，取表達呈陽性小鼠的脾臟，分離脾細(xì)胞，然后融合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，得到雜交瘤細(xì)胞；在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測得到抗體表達陽性克隆，提取陽性雜交瘤細(xì)胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)抗體基因的cDNA，再通過PCR擴增獲得相應(yīng)抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，由此實現(xiàn)本發(fā)明。

本發(fā)明提供了下述各項：

抗地克珠利單克隆抗體可變區(qū)序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為

GATGTGAAGCTTCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGGTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTCGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCGTGTACCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAGGCGATGATAACTACGCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA-VH和