[發(fā)明專利]一種利用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中分離外泌體的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810981057.2
• 申請(qǐng)日: 2018-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN109082400A
• 公開（公告）日: 2018-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳軍歌;邢婉麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 博奧生物集團(tuán)有限公司;清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/00
• 分類號(hào): C12N5/00;G01N33/569
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;秦夢(mèng)楠

本發(fā)明公開了一種利用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中分離外泌體的方法。本發(fā)明提供了一種從生物樣品中分離外泌體的方法，是采用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中分離外泌體。所述DEAE磁納米顆粒的粒徑為200?30000nm。所述方法包括如下步驟：(1)采用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中捕獲外泌體；(2)采用洗脫液分離DEAE磁納米顆粒上的外泌體。本發(fā)明提供的方法可以實(shí)現(xiàn)高效率地分離高純度的外泌體，然后對(duì)捕獲的外泌體進(jìn)行蛋白和核酸分析，進(jìn)一步應(yīng)用與生物檢測(cè)或醫(yī)療檢驗(yàn)中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中分離外泌體的方法。

背景技術(shù)

外泌體是一種細(xì)胞分泌至細(xì)胞外的直徑在30-150nm的膜性囊泡。細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用將胞外的物質(zhì)攝入胞內(nèi)形成小囊泡，隨后，小囊泡發(fā)生融合形成早期核內(nèi)體并進(jìn)一步演變?yōu)橥砥诤藘?nèi)體。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一些蛋白和miRNA進(jìn)入晚期核內(nèi)體進(jìn)而演變成多泡體。小囊泡被釋放到胞外從而形成外泌體。細(xì)胞培養(yǎng)基以及體液(血漿、血清、尿液、唾液等)中都有外泌體的存在。外泌體的外膜為磷脂雙分子層，并含有一些功能蛋白。外泌體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂類、mRNA、miRNA等。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，外泌體廣泛參與細(xì)胞通訊、免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程。腫瘤分泌的外泌體含有腫瘤特異性的蛋白、microRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA，因此可以通過(guò)檢測(cè)腫瘤分泌的外泌體來(lái)實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷。想要外泌體的快速、高效的提取分離是外泌體研究的基礎(chǔ)。

現(xiàn)有的外泌體分離提取方法主要有超高速離心，免疫法，超濾法，商業(yè)化試劑盒，色譜排阻等。超高速離心先通過(guò)差速離心除去細(xì)胞及碎片，然后超高速離心(16000rpm)富集外泌體。超高速離心法一般需要6-8小時(shí)，回收率比較低，只有5-25％，費(fèi)用昂貴。免疫法主要是利用抗體修飾的磁珠來(lái)捕獲外泌體，得到的外泌體高純度，回收率高。但普適性低，只捕獲含有目標(biāo)蛋白的外泌體，容易造成失真的分析。超濾法是利用抽真空的方法使含外泌體的溶液通過(guò)微濾膜，從而把外泌體富集在微濾膜上，這種方法富集效率比較高，但是易于堵塞，而且外泌體會(huì)受到壓力損傷。現(xiàn)已有一些商業(yè)化的試劑盒(比如ExoQuick，TotalExosome Isolation)來(lái)提取外泌體，使用方便，但需要過(guò)夜操作，且操作環(huán)境開放，可能會(huì)有化學(xué)試劑殘留影響后續(xù)qPCR、測(cè)序等操作。許多這些常規(guī)的外泌體分離技術(shù)都具有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中分離外泌體的方法。

本發(fā)明提供了一種從生物樣品中分離外泌體的方法，是采用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中分離外泌體。

所述DEAE磁納米顆粒的粒徑為200-30000nm。

所述DEAE磁納米顆粒的粒徑具體可為200nm。

所述方法包括如下步驟：

(1)采用DEAE磁納米顆粒從生物樣品中捕獲外泌體；

(2)采用洗脫液分離DEAE磁納米顆粒上的外泌體；

所述洗脫液為鹽溶液，和/或，所述洗脫液的pH值為6-9。

所述洗脫液為含有100-500mMNaCl和50mM HEPES的水溶液。

所述洗脫液具體可為含有200mMNaCl和50mM HEPES的水溶液。

所述洗脫液的pH具體可為7.2。

所述步驟(1)中，DEAE磁納米顆粒的濃度為0.5-3mg/mL，

和/或，DEAE磁納米顆粒與生物樣品的孵育時(shí)間為5-30min。

所述步驟(1)中，DEAE磁納米顆粒的濃度具體為5mg/mL，

和/或，DEAE磁納米顆粒與生物樣品的孵育時(shí)間具體為10min。