[發明專利]禽腺病毒4型卵黃抗體及其制備方法

在審

• 申請號: 201810977191.5
• 申請日: 2018-08-26
• 公開（公告）號: CN109053880A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發明（設計）人: 張毓金;謝秉超;嚴悌昆;敖艷華;劉為和
• 申請（專利權）人: 廣州漁躍生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C07K16/02
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 鐘小敏

本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及禽腺病毒4型卵黃抗體的制備方法，包括A)用禽腺病毒4型滅活疫苗免疫蛋雞，獲得免疫雞蛋，進一步獲得卵黃液；B)將上述卵黃液與Tris?HCl緩沖鹽溶液混合，加入苯酚溶液，混勻，靜置，低速離心，收集上清液；C)往上清液中加入終濃度為0.2～1.0(m/v)的聚乙二醇15?羥基硬脂酸酯，攪拌混合，靜置一定時間，離心，收集上清液；D)將上清液經純化、濃縮、無菌步驟，即得。本發明提供的禽腺病毒4型卵黃抗體制備方法因為不涉及后續的凝膠層析等操作，成本低，操作簡便，同時通過對提取步驟和純化步驟的改良，使得抗體的回收率、去脂率顯著高于現有方法，取得了顯著的進步。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及禽腺病毒4型卵黃抗體及其制備方法。

背景技術

卵黃抗體(immunoglobulin of egg yolk，IgY)是禽卵黃中存在的免疫球蛋白，是由禽血液中的IgG轉移至卵黃中產生的對子代具有保護性作用的抗體。IgY的分子質量約為180ku，由2條輕鏈和2條重鏈組成，其中輕鏈分子質量約22～30ku，重鏈分子質量為67～70ku，等電點接近5.2。與IgG相比，IgY具有動物種系發生學距離的優勢，更適于生產特異性抗體。由于IgY具有獨特的理化性質和生物學特性，用作禽宿主來產生抗特定抗原的IgY正逐漸受到學者的關注。

卵黃中約含有30％的脂類(水分約占48％，蛋白質約占18％)，其中大部分脂肪與蛋白質以脂蛋白的形式存在。卵黃包括水溶性蛋白(α-卵黃球蛋白、β-卵黃球蛋白、γ-卵黃球蛋白(IgY))。而高質量的IgY，其必須純度高，同時，抗體回收率要高。

而要提取IgY首先要獲得水溶性成分(water soluble fraction,WSF)，目前國內外學者已展開了廣泛的研究，如現有技術CN104072609A中發明人向蛋黃液中加入泊洛沙姆提取WSF；如CN101717445B中發明人用聚乙二醇獲得水溶性蛋白WSF；V.Ntakarutimana等將含有氯仿的TBS緩沖鹽溶液加入到蛋黃液中提取WSF[NTAKARUTIMANA V，DEMEDTS P，VanSANDE M，et al.A simple and economical strategy for downstream processingof specific antibodie s to human transferrin from egg yolk[J].J ImmunolMethods，1992，153(1/2):133-140.]。但上述方法中卵黃抗體的回收率最高不超過80％。

高質量卵黃抗體的制備另一個關鍵步驟在于純化步驟。目前較為常用的純化方法鹽析法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法、疏水層析法等。其中，鹽析法簡單、經濟，但是提取的IgY純度低(不超過70％)，脂肪殘留量高；而層析法雖然能得到高純度的IgY(90％)，但是其產率低，且費用高，不適宜大規模應用，僅適用于科研。

發明內容

本發明旨在提供禽腺病毒4型卵黃抗體及其制備方法，該方法適用于實際生產卵黃抗體，因為其成本低，且卵黃抗體回收率最高可達96.6％，更重要的脂肪殘留量低，低于1％。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案：禽腺病毒4型卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：

A)用禽腺病毒4型滅活疫苗免疫蛋雞，獲得免疫雞蛋，經消毒后，分離蛋白，收集卵黃，進一步獲得卵黃液；

B)將上述卵黃液與Tris-HCl緩沖鹽溶液混合，加入苯酚溶液，混勻，靜置，低速離心，收集上清液；

C)往上清液中加入終濃度為0.2～1.0(m/v)的聚乙二醇15-羥基硬脂酸酯，攪拌混合，靜置，離心，收集上清液；

D)將步驟C)得到的上清液經純化、濃縮、無菌步驟，得到卵黃抗體。

優選地，所述步驟B)中卵黃液與Tris-HCl緩沖鹽按1：(3～6)的體積比混合。