[發明專利]一種提取棗樹葉片中的DNA的方法

在審

• 申請號: 201810965302.0
• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN110835627A
• 公開（公告）日: 2020-02-25
• 發明（設計）人: 李春麗
• 申請（專利權）人: 上海律仕醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種提取棗樹葉片中的DNA方法。本發明提供的提取棗樹葉片中的DNA方法包括如下步驟：選取新鮮棗樹嫩葉于冰箱內下暗處理、研磨、加入第一緩沖液、恒溫水浴中、離心、加入酚、氯仿和異戊醇混合液、離心、加入氯仿、異戊醇混合液、離心、加入第二緩沖液、加入冷乙醇漂洗、加入第三緩沖液過夜溶解等步驟。使用本發明提供的方法提取的DNA純度較高，濃度較大，本發明還提高了DNA提取的效率。

技術領域

本發明涉及一種DNA提取方法，尤其涉及一種提取棗樹葉片中的DNA的方法。

背景技術

黃原酸鹽，由于顏色發黃，俗稱黃藥，是金屬硫化礦浮選最常用的捕收劑。幾乎所有品種的黃藥均可作為泡沫浮選的捕收劑。近年來，隨著納米科技的迅速興起，黃藥作為制備硫化物納米粒子前驅體的研究再一次引起了人們對這種傳統浮選捕收劑的關注。PEX(potassium ethyl xanthate)屬于黃藥類試劑，在常溫下是淡黃色粉末狀固體，常因雜質存在而顏色稍深，有刺激性臭味，具有一定的毒性，所以在操作的時候要注意防護。

眾所周知，要從植物組織或細胞中得到高質量的DNA，尤其當植物被用作原材料時，步驟會比較復雜。而對于帶有多糖、堅硬的細胞壁、色素或次生代謝復雜的化學成份較多的植物來說，在分離過程中必須特殊考慮這些成分，要提取到好的DNA，更是比較困難。

棗樹各組織中蛋白質、酚類、單寧、色素、多糖含量較高，尤以生長旺盛的幼嫩組織為甚。當植物組織所含的蛋白質等諸多物質含量高時，嚴重影響基因組DNA提取質量，很容易出現DNA呈黏稠狀的現象，槍頭難以吸取，各類酶對其作用時將完全或部分失去活性。對于ISSR分子標記技術，它是一種迅速、簡單、可靠、靈敏并且能夠提供豐富基因組信息的DNA指紋技術，是基于PCR技術為基礎的，因此ISSR易于受到PCR的影響因素(如模板濃度、引物、溫度、Taq DNA酶以及Mg²⁺濃度等)的影響。若提取的DNA有降解，或者純度不夠，實驗無結果或者結果不穩定。

到目前為止，已經出版的關于棗樹DNA的提取方法。主要是利用SDS或CTAB試劑，一般CTAB提取純化時步驟比較多，DNA丟失比較嚴重，提取到的DNA量相對較少；SDS法雖簡便，但一般提取的純度又不夠，尤其對于成分復雜的棗樹種類來說，提取到高純度的基因組DNA比較困難。

發明內容

為了克服現有技術中存在的問題，本發明提供一種使用PEX方法對棗樹葉片中的DNA進行提取的方法。

本發明提供了的使用PEX方法對棗樹葉片中的DNA進行提取的方法包括以下步驟：1、一種提取棗樹葉片中的DNA方法，包括如下步驟：a)選取新鮮棗樹嫩葉，于冰箱內0～4℃下暗處理48h，快速稱取0.1g于液氮中研磨成細粉，取其快速地轉移到1.5mL EP管中，加入65℃預熱的800μL的第一緩沖液混勻，第一緩沖液包括2.5mM的PEX、濃度為4％(g/mL)的可溶性PVP、100mM pH值為7.5的Tris、10mM pH值為7.5的EDTA、濃度為2％(μL/mL)的β-巰基乙醇、700mM NaCl；b)65℃恒溫水浴中溫育20min，每5min輕輕顛倒混勻一次；取出后，13000rpm室溫離心5min；c)取上清，向其中加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液，其中酚、氯仿、異戊醇的體積比為25∶24∶1，上下顛倒混勻，13000rpm離心5min；d)取上清，加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其中氯仿、異戊醇混合液中氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1，顛倒混勻，13000rpm離心5min；e)移上清液至一加有700μL預冷的異丙醇的2mL EP管中，再加入150μL第二緩沖液后輕輕上下顛倒混勻，所述第二緩沖液是3M pH值為5.2的NaAC；13000rpm于4℃離心10min，倒掉上清收集沉淀；f)將沉淀中加入1mL70％的冷乙醇漂洗，重復兩次，倒掉乙醇室溫或真空干燥沉淀；g)加入50μL第三緩沖液，所述第三緩沖液是RTE，其中含有20ug/mL的pH值為8.0的RNase，4℃條件下過夜溶解。

附圖說明