[發(fā)明專利]一種非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810937814.6
• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN109055304B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪玥
• 申請（專利權(quán)）人: 洪玥
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;宋靜娜

本發(fā)明公開了一種非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含以下組分：cFAD培養(yǎng)液、TGFβ通路抑制劑和ROCK抑制劑。本發(fā)明還公開了利用所述培養(yǎng)基進(jìn)行非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)的方法。本發(fā)明所述非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)基突破現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，使得長時(shí)間單克隆培養(yǎng)成為可能，能夠支持層狀/假層狀/移型上皮等多種非柱狀上皮干細(xì)胞在體外分離后以細(xì)胞池或單細(xì)胞形式高效地、穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增，是實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞病理缺陷鑒定及進(jìn)行后續(xù)功能修復(fù)的技術(shù)前提，可服務(wù)于細(xì)胞精準(zhǔn)醫(yī)療產(chǎn)品的開發(fā)和制備。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞研究是再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要基礎(chǔ)和核心推動力。胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性干細(xì)胞和組織成體干細(xì)胞是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的三大分支。憑借細(xì)胞安全性高、易于獲取的顯著優(yōu)勢，組織成體干細(xì)胞越來越多的受到干細(xì)胞醫(yī)學(xué)行業(yè)的關(guān)注。組織成體干細(xì)胞進(jìn)一步下分為間充質(zhì)干細(xì)胞與上皮組織干細(xì)胞兩大類。其中來源于骨髓、脂肪、臍帶等組織的間充質(zhì)干細(xì)胞由于分離培養(yǎng)相對簡單，被廣泛用于治療移植抗宿主病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及關(guān)節(jié)炎癥等方面研究。然而，實(shí)質(zhì)器官疾病的發(fā)生與組織修復(fù)與其上皮組織干細(xì)胞戚戚相關(guān)，治療手段直接依賴于對相應(yīng)上皮組織干細(xì)胞的認(rèn)知和利用。不同上皮類型的組織干細(xì)胞，例如層狀/假層狀、移型、柱狀上皮干細(xì)胞等，具有很高的組織忠實(shí)度，即專能分化能力，能在體外自覺定向分化為與來源組織細(xì)胞組成類型相一致的各類細(xì)胞。然而，不同上皮類型的組織干細(xì)胞在體外克隆、增殖階段對培養(yǎng)微環(huán)境有不同的喜好與需求。如何營造最契合的體外微環(huán)境以支持穩(wěn)定、高效、便捷的組織干細(xì)胞擴(kuò)增是急需深入探索有待開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)領(lǐng)域。自此類干細(xì)胞1975年被首次發(fā)現(xiàn)至今，受限于培養(yǎng)技術(shù)條件，行內(nèi)對上皮組織干細(xì)胞的研究和利用仍十分有限，取得關(guān)鍵突破的團(tuán)隊(duì)相對集中。

至今已報(bào)道的培養(yǎng)技術(shù)有以下幾種：(1)基于腸道柱狀細(xì)胞建立的“細(xì)胞類器官”organoid culture培養(yǎng)法(Clevers,Cell,2016)；(2)本發(fā)明人參與開發(fā)的基于腸道干細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)分化平臺(Wang,et al.,Nature,2015)；(3)基于皮膚上皮細(xì)胞建立的滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法(Rheinwald and Green,Cell,1975；Barrandon and Green,PNAS,1987)。其中，細(xì)胞類器官培養(yǎng)法是對組織干細(xì)胞、中間態(tài)細(xì)胞、終端分化細(xì)胞進(jìn)行的一種混合培養(yǎng)方式，其優(yōu)勢在于能夠由培養(yǎng)系統(tǒng)自發(fā)生成干細(xì)胞生長所需的大部分分泌蛋白及信號調(diào)控因子，模擬體內(nèi)微環(huán)境，適合對不熟悉的組織干細(xì)胞進(jìn)行短期的體外維系。但是，此培養(yǎng)系統(tǒng)無法進(jìn)行單細(xì)胞層面的研究，對了解干細(xì)胞的分化潛能、譜系、病理基因缺陷，以及細(xì)胞治療領(lǐng)域的編輯應(yīng)用等方面操作是很大的制約；利用Dr Green培養(yǎng)法，層狀上皮干細(xì)胞，以皮膚上皮干細(xì)胞與角膜上皮干細(xì)胞為代表，能夠通過體外擴(kuò)增完成制備，并分別于1981年和2008年成功用于臨床再生。但是對于更多的非柱狀上皮干細(xì)胞(如呼吸道上皮、泌尿道上皮等)，尤其是其單細(xì)胞克隆的體外長期穩(wěn)定培養(yǎng)仍是瓶頸。

現(xiàn)有培養(yǎng)體系無法對層狀/假層狀上皮干細(xì)胞的體外擴(kuò)增提供足夠長時(shí)間的穩(wěn)定支撐。干細(xì)胞克隆在一定次數(shù)傳代后呈漸減式生長、出現(xiàn)“老化”現(xiàn)象。現(xiàn)有條件難以實(shí)現(xiàn)層狀/假層狀上皮干細(xì)胞單細(xì)胞克隆及后續(xù)有效擴(kuò)增。此技術(shù)平臺的空白制約了對不同上皮組織干細(xì)胞的持續(xù)發(fā)掘以及更多新型干細(xì)胞治療產(chǎn)品的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，其使得長時(shí)間單克隆培養(yǎng)成為可能，能夠支持層狀/假層狀/移型上皮等多種非柱狀上皮干細(xì)胞在體外分離后以細(xì)胞池或單細(xì)胞形式高效地、穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種非柱狀上皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含以下組分：cFAD培養(yǎng)液、TGFβ通路抑制劑和ROCK抑制劑。