[發明專利]一種減毒棒狀病毒的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201810913350.5
• 申請日: 2018-08-10
• 公開（公告）號: CN110819657B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 秦曉峰;吳飛
• 申請（專利權）人: 睿豐康生物醫藥科技（浙江）有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N7/01;C12N15/13;C07K16/28;A61K39/395;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

1.一種減毒病毒載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（S1）將如SEQ ID NO:1所示的編碼水皰性口炎病毒基質蛋白的基因的核苷酸序列和第一載體混合，加入轉座酶進行轉座反應；

（S2）將步驟（S1）得到的轉座產物和感受態細菌混合，進行轉化；

（S3）提取通過步驟（S2）得到的細菌的質粒，得到轉座后的所述編碼水皰性口炎病毒基質蛋白的基因；

（S4）將步驟（S3）得到的所述基因重組至第二載體中，得到所述減毒病毒載體；

其中，所述編碼第二載體的序列包含水皰性口炎病毒的基因組序列；

其中，所述第一載體選自具有轉座功能的載體；

所述第一載體包含如SEQ ID NO:2所示的序列；

所述第二載體包含如GENBANK編號為EU849003.1所示的序列；

所述編碼減毒病毒載體的序列包含如SEQ ID NO：4所示的序列。

2.一種減毒病毒載體，其通過權利要求1所述的制備方法得到。

3.一種克隆骨架載體系統，其特征在于，所述克隆骨架載體系統將如SEQ ID NO:5所示的序列重組至如權利要求2所述的載體中；其中，所述SEQ ID NO:5所示的序列插入編碼如權利要求2所述的載體的位點為如SEQ ID NO：4所示的序列的第4632位。

4.根據權利要求3所述的克隆骨架載體系統，其特征在于，編碼所述克隆骨架載體系統的序列包含如SEQ ID NO:6所示的序列。

5.一種制備減毒單克隆病毒株的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（S1）培養第一待轉染細胞；

（S2）將包含如SEQ ID NO:3所示的序列的質粒，和包含如SEQ ID NO:7所示的序列的質粒pN，包含如SEQ ID NO:8所示的序列的質粒pL，包含如SEQ ID NO:9所示的序列的質粒pP的質粒混合物，共轉染至步驟（S1）中的待轉染細胞中；

（S3）提取步驟（S2）共轉染后得到的細胞混合液中的上清液，轉染至第二待轉染細胞中；

（S4）將步驟（S3）中被轉染后的第二待轉染細胞進行培養，篩選，得到減毒單克隆病毒株。

6.根據權利要求5所述的方法，其中，包含如SEQ ID NO:3所示的序列的質粒，包含如SEQ ID NO:7所示的序列的質粒pN，包含如SEQ ID NO:8所示的序列的質粒pL和包含如SEQID NO:9所示的序列的質粒pP的重量比為10:4:1:5。

7.根據權利要求5-6任一項所述的方法，其中，所述包含如SEQ ID NO:3所示的序列的質粒為包含如SEQ ID NO:4所示的序列的質粒。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述第二待轉染細胞選自Vero細胞；所述第一待轉染細胞選自BSR-T7細胞。

9.根據權利要求7所述的方法，其中，步驟（S2）中所述包含如SEQ ID NO:4所示的序列的質粒選自包含如SEQ ID NO:6所示的序列的質粒。

10.根據權利要求9所述的方法，其中，步驟（S2）中所述包含如SEQ ID NO:6所示的序列的質粒的編碼序列進一步包含如SEQ ID NO:10所示的序列和如SEQ ID NO:11所示的序列。

11.根據權利要求9所述的方法，其中，步驟（S2）中所述包含如SEQ ID NO:6所示的序列的質粒的編碼序列進一步包含如SEQ ID NO:12所示的序列。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述包含如SEQ ID NO:12所示的序列的5’端還包含信號肽序列；所述信號肽序列選自如SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的序列。