[發(fā)明專利]一種PSR檢測耐甲氧西林金葡菌的引物、試劑盒與方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810909427.1
• 申請日: 2018-08-10
• 公開（公告）號: CN109355403B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐振波;苗健;徐行勇;劉君彥;陳定強(qiáng);蘇健裕;陳玲;李曉璽;李冰;李琳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 黃瑩;宮愛鵬

1.一種PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的引物，其特征在于，包含femA的檢測引物及mecA的檢測引物，所述的檢測引物的核苷酸序列如下所示：

靶點(diǎn)femA檢測引物Ft:

5’-AGGTATAGACTTCGATGTTTCAAATCGCGGTCCAGTG-3；

靶點(diǎn)femA檢測引物Bt：

5’-TTGTAGCTTCAGATATGGAAACCAATCATTACCAGCA-3’；

靶點(diǎn)mecA檢測引物Ft：

5’-CCAATAACTGCATCATCTGCGACTTCACATCTATTAGG-3’；

靶點(diǎn)mecA檢測引物Bt：

5’-TCTACTACGTCAATAACCGACACGATAGCCATCTTCA-3’。

2.一種PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于：

包括權(quán)利要求1所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于：

所述的引物的濃度為50 μM。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于，還包括如下組分：

A、2×反應(yīng)緩沖液：40 mM的Tris-HCl，20 mM的硫酸銨，20 mM的氯化鉀，16 mM的硫酸鎂，0.2%（v/v）的Tween 20，1.4 M的甜菜堿，10 mM的 dNTPs；

B、Bst DNA 聚合酶；

C、鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于：

組分B中所述的Bst DNA 聚合酶的濃度為8 U/μL；

組分C中所述的鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液中鈣黃綠素與氯化錳的濃度比為1:（4～8）。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于：

組分C中所述的鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液中鈣黃綠素與氯化錳的濃度比為1: 4。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于，組分C通過如下方法制備得到：

（i）將鈣黃綠素溶于二甲基亞砜中，配置50 μM的鈣黃綠素溶液；將氯化錳溶于水中，配置1 mM的氯化錳水溶液；

（ii）取25 μL 50 μM的鈣黃綠素溶液與10 μL 1 mM的氯化錳水溶液混合均勻，得到鈣黃綠素和氯化錳的混合溶液。

8.權(quán)利要求1所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的引物或權(quán)利要求2～7任一項(xiàng)所述的PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試劑盒在制備檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9.一種PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法，所述的方法為非疾病診斷的實(shí)驗(yàn)研究方法，其特征在于：

利用如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的檢測引物進(jìn)行PSR等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測待檢樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； 具體包括如下步驟：

（1）提取待檢樣品的細(xì)菌DNA作為模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為1.8～2.0；

（2）分別建立檢測femA及mecA的聚合酶螺旋反應(yīng)體系，于65℃水浴中保溫40～45分鐘進(jìn)行聚合酶螺旋擴(kuò)增反應(yīng)；其中，所述的聚合酶螺旋擴(kuò)增反應(yīng)體系為26 μL反應(yīng)體系：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，50 μM的檢測引物Ft和50 μM的檢測引物Bt各0.8 μL，DNA模板2 μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1 μL，加水補(bǔ)足至25 μL；最后加入1 μL的鈣黃綠素與氯化錳的混合溶液；

（3）待反應(yīng)完成后于80℃水浴中保溫2分鐘終止反應(yīng)，然后用肉眼觀察顏色變化，如其中一個(gè)反應(yīng)管顏色為黃色或兩個(gè)反應(yīng)體系都未變色，說明待檢樣品中不含有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；如兩個(gè)反應(yīng)管顏色全部變?yōu)榫G色，說明待檢樣品中含有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。