[發明專利]檢測萊克多巴胺的熒光微球-膠體金雙顯色定性定量免疫層析試紙條及其制備方法

有效

• 申請號: 201810905486.1
• 申請日: 2018-08-09
• 公開（公告）號: CN109061205B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 陳媛;賴衛華;羅凱;劉文娟;伍燕華
• 申請（專利權）人: 江西中德生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/94
• 分類號: G01N33/94;G01N33/58;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533;G01N33/532
• 代理公司: 南昌大牛知識產權代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 喻莎

1.一種檢測萊克多巴胺的熒光微球-膠體金雙顯色定性定量免疫層析試紙條，其特征在于：包括底板，以及在底板上依次地搭接粘貼的濾紙，樣本墊，玻璃纖維墊，硝酸纖維素膜和吸水紙，其中所述的玻璃纖維墊上噴涂有熒光微球和膠體金分別標記了萊克多巴胺單抗的復合物，所述的硝酸纖維素膜上包被有萊克多巴胺人工抗原作為檢測線和包被有山羊抗小鼠抗體作為質控線；

時間分辨熒光微球是直徑為0.01～10μm的較長熒光半衰期的稀土離子作為標記物來制備的包裹熒光物質的特殊微球，所述熒光微球表面連接有活性基團；所述熒光物質包括有機或無機的熒光物質或多種熒光物質的摻雜物以及量子點；

所述的膠體金顆粒是直徑為30nm的采用檸檬酸三鈉還原氯金酸來制備的金顆粒，所述的膠體金顆粒表面帶有負電荷，可以與蛋白質進行偶聯；

制備方法包括如下的步驟：

⑴硝酸纖維素膜上包被有萊克多巴胺人工抗原作為檢測線和包被有山羊抗小鼠抗體作為質控線的制備方法：

①制備萊克多巴胺人工抗原

將萊克多巴胺標準品與蛋白大分子通過共價偶聯法制備質控區所需的人工抗原，偶聯方法為：1，4-丁二醚法，偶聯蛋白為牛血清白蛋白，偶聯比為1:10-1:100，偶聯后透析純化，得到萊克多巴胺人工抗原；

②檢測線和質控線的制備

萊克多巴胺人工抗原和山羊抗小鼠抗體包被到硝酸纖維素膜上；用0.02M pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋萊克多巴胺人工抗原使萊克多巴胺人工抗原濃度為0.5mg/mL，所得的溶液在硝酸纖維素膜上噴涂作為檢測線；用0.02M pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋山羊抗小鼠抗體使山羊抗小鼠抗體濃度為1mg/mL，所得的溶液在硝酸纖維素膜上噴涂作為質控線，兩線的噴膜量均為0.74μL/cm，檢測線與膜頂邊間隔10mm，兩線中間間隔5mm，37℃烘干12小時，放置于干燥柜中保存備用；

⑵玻璃纖維墊上噴涂有熒光微球和膠體金分別標記了萊克多巴胺單抗的復合物的制備方法

①熒光微球標記萊克多巴胺單抗的制備：取1mg熒光微球超聲1分鐘，用0.01M pH 6.0的硼酸鹽緩沖液調節微球濃度為0.1mg/mL，然后加入EDC使EDC終濃度為50mg/mL，振蕩混勻后，室溫孵育30min后，加入萊克多巴胺單克隆抗體使萊克多巴胺單克隆抗體終濃度為15μg/mL，充分混合后，室溫攪拌反應3h，然后加入牛血清白蛋白使牛血清白蛋白終濃度為1％，室溫反應1h，6000×g離心力離心15min，沉淀用包含5％蔗糖和0.05％Tween-20的0.01M pH7.5的磷酸鹽緩沖液復溶為起始體積后，于4℃保存待用；

②膠體金標記萊克多巴胺單克隆抗體的制備：取40mL粒徑30nm的膠體金，用0.02M的碳酸鉀溶液調節膠體金的pH為7.4，加入萊克多巴胺單克隆抗體使萊克多巴胺單克隆抗體終濃度為30μg/mL，充分混合后，室溫攪拌反應1h，加入牛血清白蛋白使牛血清白蛋白終濃度為1％，室溫反應1h，5000×g離心力離心15min，沉淀用包含5％蔗糖和0.05％Tween-20的0.01M pH 7.4的磷酸鹽緩沖液復溶為1/10起始體積后，于4℃保存待用；

③按照每張試紙條中不同標記物上的抗體量來計算，精確到膠體金標記抗體量為20ng/條、熒光微球標記抗體量為6ng/條的濃度來進行結合墊的噴涂，噴涂至30×0.8cm的玻璃纖維膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥柜中備用；檢測結果為：在步驟③的條件下標準曲線濃度為：0、0.1、0.3、0.9、1.5、2.7ng/mL，R²為0.9898，IC50為0.33ng/mL，線性回歸方程式為：y＝-0.1634x+0.1897；

⑶組裝試紙條

①濾紙和樣本墊規格為1×30cm；

②噴涂有熒光微球-膠體金復合物的玻璃纖維，規格為0.8×30cm；

③已噴好檢測線和質控線的硝酸纖維素膜，規格為2.5×30cm；

④吸水紙，規格為1.2×30cm；

⑤PVC底板，規格為5.5×30cm；

將以上材料依次粘貼，組裝好后用切刀裁切成4×55mm的試紙條，裝入塑料卡殼中，壓緊后裝入鋁箔袋，加入干燥劑后，封口保存。

2.如權利要求1所述的一種檢測萊克多巴胺的熒光微球-膠體金雙顯色定性定量免疫層析試紙條，其特征在于：所述熒光微球-膠體金雙顯色定性定量免疫層析試紙條檢測樣本中萊克多巴胺的方法，包括如下的步驟：

①在試紙加樣孔中加入110μL樣本，反應10min；

②目測試紙條檢測線和質控線出現的紅色條帶情況；

③如果檢測線顯色比質控線顯色深，則樣本中萊克多巴胺的含量小于0.5ng/mL，定性判斷為陰性，反之，如果檢測線顯色比質控線顯色淺，或者檢測線沒有顯示紅色條帶，則樣本中萊克多巴胺含量大于0.5ng/mL，定性判斷為陽性；

④根據膠體金紅色條帶顯示的結果，如果樣本為陽性時，將試紙條插入熒光讀取儀的檢測窗口，檢測線和質控線熒光的強弱會以數值的高低在顯示器上顯示，根據儀器中已經錄入的標準曲線，即可計算出樣本中萊克多巴胺的含量，實現陽性樣本的定量檢測，膠體金顯色后，在20分鐘內讀取的熒光數據均有效。