[發明專利]通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法

在審

• 申請號: 201810893652.0
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097375A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 賀建龍;熊鵬;劉曉燕;徐寧;胡磊
• 申請（專利權）人: 淮陰師范學院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/21;C12P7/56;C12R1/01
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標事務所 32110
• 代理人: 韓曉斌

本發明公開了通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法，以大腸桿菌中的木糖轉運蛋白基因序列為模板，結合乳酸菌的密碼子偏好和RNA的穩定性考量，編碼一個全新的適用于乳酸菌的木糖轉運蛋白基因序列，在乳酸乳球菌中表達此蛋白來提高利用木糖發酵乳酸效率。本發明方法通過表達木糖轉運蛋白來提高木糖利用率，相較于傳統方法更簡單快捷，發酵時間縮短12小時，乳酸產量提升16.7%~21%，具有很好的應用推廣前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種編碼的木糖轉運蛋白基因，以及通過在乳酸乳球菌中表達此蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法。

背景技術

國內外乳酸發酵進入工業化時代已有一段時間了，但發酵原料普遍采用葡萄糖或淀粉水解物等已糖。在當今對環境的重視，對糧食的珍視，非常有必要開發出以非糧食物資做為原料來生產乳酸的方法。木質纖維的主要分解產物為葡萄糖和木糖，其被視為未來最重要的原料替代物資。以往主要是通過從自然界挑選和變異優化的方法來進行發酵菌株的選育，利用已經較成熟的從葡萄糖到乳酸的發酵途徑理論知識為基礎，進行培養基、培養條件等的優化來進行乳酸發酵的研究。而乳酸菌對戊糖，特別是利用木糖發酵產乳酸的知識仍然遠遠不夠。

大部分微生物都能利用葡萄糖，但是只有很少的細菌，比如大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草桿菌（Bacillus subtilis）等能夠利用木糖。大量的研究結果顯示，因為諸多微生物的木糖轉運蛋白或木糖代謝途徑酶有或多或少的缺失致使木糖利用非常困難。

目前，作為乳酸工業生產菌株主要有根霉屬和細菌中的乳酸菌屬。根霉菌存在一些缺點：發酵溫度不高，糖酸轉化率低，發酵過程需通氣和攪拌，能耗高等不足限制了其生產乳酸的發展。隨著對細菌發酵生產乳酸各種優點的認識，比如代謝快，可以縮短發酵周期；耐受溫度高，可以減少發酵過程中對冷卻水的消耗，同時也減少了染菌概率等各種好處。

隨著分子生物學的發展，很多乳酸菌的基因序列已經測序完成，比如植物乳桿菌有3種，乳酸乳球菌有7種，德氏乳桿菌有4種已經公布其序列。根據已公布的基因序列可知乳酸乳球菌含有完整的木糖代謝途徑的酶和木糖轉運蛋白。文獻（Two differentpathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration onthe yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lacticacid bacterium Lactococcus lactis 10-1）中，K. Tanaka就是利用乳酸乳球菌發酵木糖產乳酸。但是除乳酸乳球菌以外的乳酸菌大都沒有完整的木糖代謝途徑。也有些研究人員是利用傳統方法從自然界挑選和變異來得到木糖發酵乳酸菌，但此種方法將會是一個長期、工作量大并且靠運氣的工作。如果通過傳統的方法得到了可以利用木糖發酵產乳酸的乳酸菌，接著再利用傳統的變異等方法來提高產乳酸效率，將又會是一個長期、工作量大并且靠運氣的工作。

發明內容

本發明的目的是：設計一種通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法，以大腸桿菌中的木糖轉運蛋白基因序列為模板，結合乳酸菌的密碼子偏好和RNA的穩定性考量，編碼一個全新的適用于乳酸菌的木糖轉運蛋白基因序列，在乳酸乳球菌中表達此蛋白來提高利用木糖發酵乳酸效率。

為實現上述目的，本發明的技術解決方案是該方法包括以下步驟：

（1）配制培養基：將培養基分別配制，并在各個固體培養基配方的基礎上分別加20g/L瓊脂，培養基滅菌方式為121 ℃，20 min；其中，各個培養基配方如下：

PDA培養基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L；