[發明專利]通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法

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• 申請號: 201810893652.0
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097375A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 賀建龍;熊鵬;劉曉燕;徐寧;胡磊
• 申請（專利權）人: 淮陰師范學院
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/21;C12P7/56;C12R1/01
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標事務所 32110
• 代理人: 韓曉斌

1.通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法，以大腸桿菌中的木糖轉運蛋白基因序列為模板，結合乳酸菌的密碼子偏好和RNA的穩定性考量，編碼一個全新的適用于乳酸菌的木糖轉運蛋白基因序列，在乳酸乳球菌中表達此蛋白來提高利用木糖發酵乳酸效率。

2.根據權利要求1所述的通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法，其特征是該方法包括以下步驟：

（1）配制培養基：將培養基分別配制，并在各個固體培養基配方的基礎上分別加20g/L瓊脂，培養基滅菌方式為121 ℃，20 min；其中，各個培養基配方如下：

PDA培養基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L；

LB培養基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；

乳酸菌種子培養基（MRS）：酪蛋白胨 10g/L，牛肉浸取物 10g/L，酵母提取液 5g/L，葡萄糖 5g/L，乙酸鈉 5g/L，檸檬酸二銨 2g/L，吐溫80 1g/L，磷酸氫二鉀2g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，一水硫酸錳 0.05g/L，碳酸鈣 10g/L；

乳酸發酵培養基：葡萄糖 5g/L，木糖 50g/L，牛肉浸取物 10g/L，酵母提取物 15g/L，磷酸氫二鉀2g/L,七水硫酸鎂0.6g/L,一水硫酸錳0.1g/L,七水硫酸亞鐵 0.2g/L；

（2）編碼木糖轉運蛋白基因和所需引物的制備：由南京金斯瑞生物科技有限公司制作編碼木糖轉運蛋白基因XylE，長度為1476bp；由南京金斯瑞生物科技有限公司制作引物序列；其中，Lp啟動子引物Fp序列為CCGGGGATCGATCCTCTTCAATGCTCTCCGTAGTCG，Rp序列GTATTGAGTGTTCATGATGTAGTCCTCCGT；Lt終止子引物Ft序列為ACTGCTACTCTTTAAATGGTAGTTAAAGTT，Rt序列CAGACTTTGCAAGCTCATCGGCCATTGGTGCTAAAC；

（3）乳酸乳球菌glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapA）基因的啟動子和終止子基因片段的獲得：從穿刺試管中挑取一環乳酸乳球菌接種于種子培養基10mL，37℃，螺口試管靜置培養至OD₆₆₀到0.6后，用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit進行乳酸乳球菌基因組DNA提取；以提取的基因組DNA做為模板，使用引物Fp和Rp，獲得gapA基因的啟動子PCR片段，長度為977bp；PCR擴增條件為：50μL反應體系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min共30個循環；使用的是Takara公司的PrimeSTAR? MaxDNA Polymerase kit；以提取的乳酸乳球菌基因組DNA做為模板，使用引物Ft和Rt，獲得gapA基因的終止子PCR片段，長度為517bp；PCR擴增條件為：50μL反應體系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，35s共30個循環；使用的是Takara公司的PrimeSTAR? Max DNA Polymerasekit；PCR結束后，2%瓊脂糖膠回收片段，測定濃度；膠回收用的是QIAGEN公司的QIAquickGel Extraction Kit；回收的片段分別命名為Pgx和Tgx；

（4）編碼表達基因的獲得：利用Overlap PCR方式進行編碼表達基因PXT的獲得；以編碼的XylE基因、片段Pgx和片段Tgx做為模板，使用引物Fp和Rt，獲得編碼表達基因PXT的PCR片段，長度為2940bp；PCR擴增條件為：50μL反應體系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30個循環；使用的是Takara公司的PrimeSTAR? Max DNA Polymerase kit；PCR結束后，1%瓊脂糖膠回收片段，測定濃度；膠回收用的是QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit；

（5）重組質粒pMG36e-PXT的制備：質粒pMG36e使用HindIII和XbaI進行雙酶切后，純化回收酶切后線型質粒片段，和編碼表達基因PXT片段構建重組質粒pMG36e-PXT；構建方法和試劑采用Takara公司的In-Fusion HD Cloning Plus kit；

乳酸乳球菌感受態細胞的制備及轉化：

（6-1）將乳酸乳球菌單菌落接入3 mL MRS液體培養基中，37 ℃螺口試管靜置培養12h，再按1%的接種量接種至50 mL液體MRS培養基（不含碳酸鈣）中，37 ℃螺口試管靜置培養至OD₆₆₀=0.6，冰浴10 min，于4℃、4500 r/min離心7min來收集細胞，去上清，分別用冰浴預冷的1mmol/L MgCl₂和300g/L聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）洗滌細胞，最后將細胞重懸于300g/L PEG中，電轉化備用；

（6-2）取50μg重組質粒pMG36e-PXT與100μL感受態細胞混勻，冰浴5min后轉入冰浴預冷的規格為0.2cm的電轉杯中，設置電轉參數（12.5 kV/cm，200 Ω）后進行電擊，電擊完畢后立即加入800μL液體MRS培養基（不含碳酸鈣），并在37 ℃靜置溫育2h，然后取80μL涂布于含50μg/mL紅霉素抗性MRS平板（不含碳酸鈣），37 ℃厭氧培養48h后含有重組質粒的轉化子長出；

（6-3）將挑選出的乳酸乳球菌轉化子進行菌落PCR驗證陽性菌落；PCR驗證條件為：50μL反應體系；98℃，10s；60℃，15s；72℃，3min共30個循環；引物為Fp和Rt；使用的是Takara公司的PrimeSTAR? Max DNA Polymerase kit；驗證后接種至含50μg/mL紅霉素抗性MRS液體培養基（不含碳酸鈣）37℃螺口試管靜置培養OD₆₆₀=0.6，加入同等體積的消毒過的20%甘油混勻后放入-80℃冰箱保存；

（7）利用木糖產乳酸效果驗證：將攜帶有質粒pMG36e-PXT的乳酸乳球菌進行利用木糖產乳酸發酵驗證，37℃，發酵72h結束，每12h檢測木糖殘余量和乳酸含量。

3.根據權利要求1所述的通過表達木糖轉運蛋白來提高乳酸乳球菌利用木糖發酵乳酸效率的方法，其特征是：所述編碼的木糖轉運蛋白基因的核苷酸序列為SEQ ID:1。