[發明專利]一種不依賴于基因型的植物基因編輯方法

在審

• 申請號: 201810876907.2
• 申請日: 2018-08-03
• 公開（公告）號: CN109182371A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 劉相國
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46;A01H6/54;A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

1.一種不依賴于基因型的植物基因編輯方法，其特征在于，以含有基因編輯功能元件的轉基因植物株系和具有單倍體誘導效率的植物株系作為基礎材料，制備用于基因編輯的具有工具屬性的基因編輯中間載體工具，利用該基因編輯中間載體工具，通過雜交同時實現植物單倍體誘導和目標基因編輯，所述基因編輯功能元件包含具有引導基因編輯酶到目標靶點的gRNA序列。

2.根據權利要求1所述的植物基因編輯方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、構建一種含有基因編輯功能元件的植物表達載體，該植物表達載體進入植物體內后能夠實現對目標基因的有效編輯；

步驟二、以能夠遺傳轉化的植物材料作為受體材料，利用構建的植物表達載體，進行植物遺傳轉化，培育轉基因植物植株；

步驟三、含有基因編輯功能元件的轉基因植物株系與具有單倍體誘導效率的植物株系進行雜交，產生F1代植株和后代衍生材料，命名為基因編輯中間載體工具；

步驟四、以基因編輯中間載體工具作為父本工具，對目標編輯植物株系進行授粉，獲得雜交后代；

步驟五、雜交后代材料篩選獲得單倍體，種植在溫室或田間，單倍體植株加倍，去除雜合體和非整倍體；

步驟六、基因型分析，PCR測序鑒定獲得基因編輯植株；

步驟七、自交授粉后獲得非轉基因、目的基因發生編輯的植物雙單倍體純合株系。

3.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，所述植物表達載體含有除草劑草銨膦抗性和基因編輯功能元件。

4.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，所述基因編輯功能元件為CRISPR-Cas9、CRISPR-cpf1、轉錄激活樣效應因子核酸酶或鋅指核酸酶。

5.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，步驟二中，所述受體材料為玉米品系、水稻品系、高粱品系或大豆品系。

6.根據權利要求5所述的植物基因編輯方法，其特征在于，所述玉米品系為HiII或B104，所述高粱品系為吉2731或keller，所述水稻品系為吉粳88或日本晴，所述大豆為Williams82或沈農9號。

7.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，步驟二中，所述植物遺傳轉化方法采用農桿菌介導的植物遺傳轉化方法。

8.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，步驟五中，采用選擇小苗進行流式細胞儀檢測方法或采用幼胚顏色篩選方法進行單倍體篩選。

9.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，步驟五中，采用除草劑涂抹方法，或采用Bar檢測試紙進行檢測，然后進行轉基因載體元件PCR測序確認方法，或采用全基因組測序方法實現雜合體的去除。

10.根據權利要求2所述的植物基因編輯方法，其特征在于，步驟六中，采用編輯靶點PCR測序方法或采用全基因組測序方法進行基因型分析。

11.利用權利要求1至10中任意一項所述的植物基因編輯方法獲得的基因編輯中間載體工具，其特征在于，該基因編輯中間載體工具同時具有植物單倍體誘導和目標基因編輯功能。

12.制備權利要求11所述的基因編輯中間載體工具的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、構建一種含有基因編輯功能元件的植物表達載體，該植物表達載體進入植物體內后能夠實現對目標基因的有效編輯；

步驟二、以能夠遺傳轉化的植物材料作為受體材料，利用構建的植物表達載體，進行植物遺傳轉化，培育轉基因植物植株；

步驟三、得到的轉基因植物植株中選擇具有基因編輯能力的的單株A作為父本，選擇具有單倍體誘導效率的株系B作為母本進行雜交，產生的F1代或在后代中進一步篩選具有植物單倍體誘導能力且含有轉基因成分的陽性植株即為基因編輯中間載體工具。