[發(fā)明專利]檢驗核酸擴增均一性的質(zhì)量控制標準品及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810874077.X
• 申請日: 2018-08-03
• 公開（公告）號: CN109306376B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁國紅;朱修銳;郭永;高華方;馬旭;王勇斗
• 申請（專利權(quán)）人: 國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所;清華大學(xué);北京羿賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種檢驗核酸擴增均一性的質(zhì)量控制標準品及其制備方法，所述標準品的核酸序列包括第一序列和第二序列，所述第一序列從5’?3’方向順序地包括以下序列：Tran、B、D、E、Tran*、M和H，其中B、D和E構(gòu)成一端啞鈴的環(huán)；所述第二序列從5’?3’方向順序地包括以下序列：Tran、B、D、K、Tran*、L和H*，其中B、D和K構(gòu)成另一端啞鈴的環(huán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢驗核酸擴增均一性的質(zhì)量控制標準品及其制備方法。

背景技術(shù)

擴增均一性是DNA測序(DNA-seq)方法的一個關(guān)鍵限制，其不僅導(dǎo)致拷貝數(shù)目變異偏差，而且導(dǎo)致單核苷酸變異擴增偏差，對于單細胞測序尤為重要。單細胞DNA-seq方法多以指數(shù)增長的PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，指數(shù)式的擴增所造成極大的數(shù)量偏差，使得原始序列的拷貝數(shù)信息丟失，擴增不均一而降低覆蓋率，同時由于錯誤擴增問題，指數(shù)性放大擴增偏差，導(dǎo)致測序假陽性的產(chǎn)生，進一步限制了單細胞DNA-seq的準確性。雖然通過額外的統(tǒng)計學(xué)方法可進行錯誤修正，并發(fā)現(xiàn)單堿基突變，但對于單細胞測序而言，由于缺乏好的對照，錯誤修正尤為困難，關(guān)鍵是我們根本不知道單個細胞之間究竟會有多少個變異。但基于線性擴增的核酸擴增測序過程，與以指數(shù)擴增基礎(chǔ)的方法相比，在擴增基因覆蓋率、保真性等所有指標上都有大幅度提高，讓單細胞擴增與測序更加精準。

基于線性的擴增方法是使用Tn5轉(zhuǎn)座酶在基因組內(nèi)引入隨機轉(zhuǎn)座子序列，使基因組DNA被分割成小片段DNA的基礎(chǔ)上進行的。Tn5轉(zhuǎn)座酶切DNA的位置并非固定，也即即使完全相同的基因組DNA，重復(fù)實驗過程中，經(jīng)酶切后所得片段序列及長短也各不相同。基因組DNA經(jīng)Tn5 轉(zhuǎn)座酶切后，后續(xù)還需要經(jīng)過缺口補平，鏈置換；體外轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄等步驟完成單細胞基因組的擴增過程。面對轉(zhuǎn)座后得到的核酸序列和長度不確定的DNA片段的海洋，如何重復(fù)可控其后續(xù)反應(yīng)？為此我們設(shè)計并制備了可用于基于線性擴增的核酸擴增測序過程的質(zhì)量控制的標準品核酸序列，在反應(yīng)的每一步，通過Sanger測序，質(zhì)量控制經(jīng)轉(zhuǎn)座酶切后的每個步驟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種檢驗核酸擴增均一性的質(zhì)量控制標準品，

所述標準品的核酸序列結(jié)構(gòu)由圖1所示，

圖1序列包括第一序列和第二序列，

其中所述第一序列從5’-3’方向順序地包括以下序列：Tran、B、D、E、 Tran*、M和H，其中B、D和E構(gòu)成一端啞鈴的環(huán)；所述第二序列從5’-3’方向順序地包括以下序列：Tran、B、D、K、Tran*、L和H*，其中B、D和 K構(gòu)成另一端啞鈴的環(huán)；所述第一序列和所述第二序列各自的Tran和Tran* 在各自形成啞鈴的環(huán)兩端，Tran為轉(zhuǎn)座酶能識別的一個已知序列，Tran*是所述Tran的互補序列，兩者之間形成雙鏈；B為能夠被轉(zhuǎn)錄酶識別的一個已知序列；D為任意長度的已知序列；E和K均為任意長度的隨機序列；H 和H*分別為任意長度的已知序列，H*是所述H的互補序列，兩者之間形成雙鏈；M和L為任意長度的已知序列或隨機序列，在M下方和L上方各自形成一個相應(yīng)長度的序列缺口；和上述各序列之間可以存在任意長度的隨機序列或已知序列。

在一種實施方式中，所述Tran是Tn家族轉(zhuǎn)座酶能識別的已知序列，優(yōu)選地為可以被Tn5轉(zhuǎn)座酶識別的已知序列；所述Tran優(yōu)選地為5’-CTG ACT CTT ATA CAC AAG T-3’、5’-CTG TCT CTT GAT CAG ATC T-3’或5’- CTG TCT CTT ATA CAC ATC T-3’，更優(yōu)選地為5’-CTG TCT CTT ATA CAC ATC T-3’。

在一種實施方式中，所述序列B為T7轉(zhuǎn)錄酶識別序列，優(yōu)選序列為5′ -TAA TACGAC TCA CTA TAG G-3’。

在一種實施方式中，所述序列D是6-60bp的已知序列，更優(yōu)選長度為 10-30bp。