[發明專利]甘薯莖尖脫毒方法

在審

• 申請號: 201810853480.4
• 申請日: 2018-07-30
• 公開（公告）號: CN109105256A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 毛碧增;孫鐘毓
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.甘薯莖尖脫毒方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、剝取無菌苗上的1～2mm長的莖尖分生組織；

2)、將莖尖分生組織接種到預培養基上進行培養，培養條件為：16小時光照，光照強度30～40μmol m^-2·s^-1，溫度為27±1℃；8小時暗培養，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養交替進行；培養時間為1～2天；

3)、將步驟2)所得的預培養后莖尖放入加載液中，室溫下加載0～60min；所述加載液為MS+1.8～2.2mol/L甘油+0.3～0.5mol/L蔗糖，pH5.8；

4)、將步驟3)所得的加載后莖尖轉至玻璃化液中，室溫下處理0～90min，得脫水后莖尖；

5)、先將步驟4)所得的脫水后莖尖放入位于載體上的玻璃化液的液滴中，然后將整個載體裝入盛滿液氮的冷凍管中，再將整個冷凍管投入液氮保持50～70min；

6)、從液氮中取出位于冷凍管內的載體，室溫下將載體迅速浸入洗滌液中，從而使莖尖從載體上脫落下來；然后再將莖尖轉入洗滌液中洗滌20～40min；

7)、將步驟6)所得的洗滌后莖尖轉入再生培養基中培養成苗；培養條件為：16小時光照，光照強度30～40μmol m^-2·s^-1，溫度為27±1℃；8小時暗培養，溫度為21±1℃；光照和暗培養交替進行；

培養時間為40～44天，得植株Ⅰ。

2.根據權利要求1中所述的甘薯莖尖脫毒方法，其特征在于：

所述玻璃化液為以下任一：

PVS2玻璃化溶液：[MS+28～32％(w/v)甘油+14～16％(w/v)乙二醇+14～16％(w/v)二甲基亞砜]+0.35～0.45mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；

PVS3玻璃化溶液：[MS+45～55％(w/v)甘油]+45～55％(w/v)蔗糖，pH5.8±0.2；

DMSO溶液：[MS+9～11％(w/v)二甲基亞砜]+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2。

3.根據權利要求2所述的甘薯莖尖脫毒方法，其特征在于：

所述步驟2)中的預培養基為：MS+0.3～0.75mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；

所述步驟6)中的洗滌液為：MS+1.0～1.4mol/L蔗糖，pH5.8±0.2；

所述步驟7)中的再生培養基為：

MS+0.4～0.6mg/LBA+0.08～0.12mg/LNAA+7～9mg/LGA₃+7～9g/L瓊脂+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2。

4.根據權利要求1～3任一所述的甘薯莖尖脫毒方法，其特征在于所述步驟5)：

載片為0.03mm厚，0.8cm×4cm大小的鋁箔紙，吸取玻璃化液滴加在鋁箔條上形成玻璃化液滴，每個玻璃化液滴為13～18μL玻璃化液，每個玻璃化液滴內放入5個脫水后莖尖，將粘有莖尖的鋁箔紙先在液氮里蘸一下，然后裝入盛滿液氮的2～10mL冷凍管中，再將整個冷凍管投入液氮50～70min。

5.根據權利要求1～3任一所述的甘薯莖尖脫毒方法，其特征在于所述步驟7)：

將洗滌后莖尖先放入恢復培養基中黑暗培養2.5～3.5d；培養條件為：21±1℃；所述恢復培養基為：MS+0.45～0.55mg/LBA+7～9g/L瓊脂+28～32g/L蔗糖，pH5.8±0.2；得恢復處理后莖尖；

再將恢復處理后莖尖轉入再生培養基中培養成苗。

6.根據權利要求1～3任一所述的甘薯莖尖脫毒方法，其特征在于所述步驟2)：

將莖尖分生組織先放入預培養基Ⅰ中預培養1天，再放入預培養基Ⅱ中預培養1天；

所述預培養基Ⅰ為：MS+0.3mol/L蔗糖，pH5.8，

所述預培養基Ⅱ為：MS+0.5mol/L蔗糖，pH5.8。