[發(fā)明專利]預(yù)防流行性乙型腦炎的DNA疫苗及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810850643.3
• 申請日: 2018-07-29
• 公開（公告）號: CN108904793B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭曉燕;王然
• 申請（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/14;C12N15/85
• 代理公司: 北京汲智翼成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11381
• 代理人: 陳曦;賈興昌

本發(fā)明公開了一種預(yù)防流行性乙型腦炎的DNA疫苗。其中，該DNA疫苗以真核表達質(zhì)粒融合SEQ ID No.1所示的抗原編碼基因構(gòu)建得到。本發(fā)明優(yōu)化后得到的prM/E同義序列，符合適宜人體高表達且利于DNA疫苗的合成和應(yīng)用。本發(fā)明所構(gòu)建的JEV DNA疫苗與現(xiàn)有DNA疫苗相比，該質(zhì)粒攜帶抗原序列精簡，保護性位點集中，不含神經(jīng)毒性位點，安全性高，經(jīng)密碼子優(yōu)化后更適于人類細胞的高表達，引入JEV信號序列，可進一步提高表達效率和目的蛋白的正確折疊和定向轉(zhuǎn)運。免疫效率更高，免疫時效更持久，可盡量少的避免因疫苗誘導(dǎo)的免疫力衰減而造成的發(fā)病率上升的現(xiàn)象，以進一步緩解我國公共衛(wèi)生壓力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA疫苗，具體地說是一種用于預(yù)防流行性乙型腦炎的DNA疫苗及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

流行性乙型腦炎病毒，又稱日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）在亞洲和西太平洋國家和地區(qū)廣泛流行，對當?shù)毓残l(wèi)生事業(yè)造成嚴重威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球約60%的人口生活在JEV流行區(qū)域，每年約有67900例流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis, JE）病例，其中75%的患者為15歲以下的兒童，該病的致死率高達20～30%，約一半幸存者留有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。

疫苗被認為是預(yù)防JE較為有效的途徑之一。近年來，雖然隨著各類JEV疫苗（主要為減毒活疫苗和滅活疫苗）的研究和廣泛應(yīng)用，JE患病率有所下降，但在疫苗普遍接種的國家中，也尚存在接種者體內(nèi)特異性抗體逐年衰減這一難以規(guī)避的現(xiàn)象，局部地區(qū)仍有小范圍流行或偶有散發(fā)病例報道。Pan等的研究指出，在JE廣泛流行的區(qū)域內(nèi)，不同年齡組血清中的JEV抗體陽性率程度與該年齡組JE發(fā)病率呈負相關(guān)。這提示目前正使用的疫苗的長效免疫效果仍有待改進，有望克服這一問題的新型疫苗亟待研發(fā)及推廣，以進一步降低發(fā)病率，緩解公共衛(wèi)生壓力。

現(xiàn)今廣泛使用的JEV疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。日本、韓國和我國臺灣地區(qū)等普遍使用滅活疫苗，但因其需要多次接種（一般為四次及以上）、價格昂貴、免疫效力持續(xù)時間短、免疫反應(yīng)類型偏向體液免疫等限制因素，WHO已建議相關(guān)國家和地區(qū)以其它類型疫苗逐步替代滅活疫苗。我國自主研發(fā)的JEV減毒活疫苗SA14-14-2，可以誘導(dǎo)高強度的中和抗體反應(yīng)，還能通過T細胞反應(yīng)產(chǎn)生高水平的IFN-γ，增強抗病毒反應(yīng)，但SA14-14-2本身除了可能發(fā)生“毒力返祖”這一減毒活疫苗的“原罪”之外，依然存在特異性抗體逐漸衰減的現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提出一種免疫保護效率高、免疫保護作用時效長的預(yù)防流行性乙型腦炎的DNA疫苗pVAX1-SA14ME。

本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供一種上述DNA疫苗pVAX1-SA14ME的構(gòu)建方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種預(yù)防流行性乙型腦炎的DNA疫苗，其中，所述DNA疫苗以真核表達質(zhì)粒融合SEQID No .1所示的抗原編碼基因構(gòu)建得到。

優(yōu)選地，所述真核表達質(zhì)粒為pVAX1載體質(zhì)粒。

一種上述預(yù)防流行性乙型腦炎的DNA疫苗的構(gòu)建方法，其中，所述方法步驟如下：

(1) 對SEQ ID No .2所示的JEV SA14-14-2株的prM/E基因進行優(yōu)化獲得SEQ IDNo .3所示的優(yōu)化基因prM/E；

(2) 在優(yōu)化基因prM/E前插入SEQ ID No .4所示的prM信號序列；

(3) 在步驟(2)制備序列上游引入ATG起始密碼子，下游引入TGA終止密碼子；

(4) 在步驟(3)制備序列上下游引入SEQ ID No .5所示的Kozak序列、限制性內(nèi)切酶識別序列BamH I和限制性內(nèi)切酶識別序列Xho I；