[發(fā)明專利]一種復合啟動子及其在提高肺炎克雷伯氏桿菌的3-羥基丙酸產(chǎn)量中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810841649.4
• 申請日: 2018-07-27
• 公開（公告）號: CN108949760B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田平芳;趙鵬;馬春路
• 申請（專利權(quán)）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;C12P7/42
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 張晶;程鳳儒

本發(fā)明提供一個復合啟動子，所述復合啟動子由2?5個tac啟動子核心序列排列而成。本發(fā)明還提供帶有該復合啟動子的載體、工程重組菌及該工程重組菌的制備方法。該帶有復合啟動子的工程重組菌可高效表達醛脫氫酶，從而快速催化3?HPA生產(chǎn)3?HP，一方面防止3?HPA的積累對細胞生長代謝的削弱，另一方面可提高3?HP的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及一種復合啟動子及其在提高肺炎克雷伯氏桿菌的3-羥基丙酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

3-羥基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP)是重要的平臺化合物，具有廣闊市場前景。化學合成3-HP難度大，分離純化困難，而且污染環(huán)境，因此制約了其大規(guī)模的應(yīng)用。生物法生產(chǎn)3-HP具有低成本、易操作、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢。肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)具有較高的甘油耐受性、較強的甘油代謝能力，且自身可合成輔酶B₁₂等特點，因此成為利用甘油生物法生產(chǎn)3-HP的優(yōu)勢宿主菌。K.pneumoniae利用甘油脫水酶(DhaB)催化甘油生成3-羥基丙醛(3-HPA)，3-HPA在醛脫氫酶(ALDH)的催化下生成3-HP。

由于甘油脫水酶的活性高于醛脫氫酶，導致3-HPA的積累，3-HPA對細胞具有毒性，因此消弱細胞的生長代謝。為了高產(chǎn)3-HP，需要提高醛脫氫酶的活性。啟動子作為重要的基因表達調(diào)控元件，其活性直接影響到外源基因能否高效表達。K.pneumoniae為非模式生物，缺少合適的強啟動子使醛脫氫酶高效表達，造成3-HP的生產(chǎn)過程轉(zhuǎn)化率較低。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種復合啟動子，該啟動子可高效表達醛脫氫酶，從而快速催化3-HPA生產(chǎn)3-HP，一方面防止3-HPA的積累對細胞生長代謝的削弱，另一方面可提高3-HP的產(chǎn)量。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種重組載體。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種上述重組載體的制備方法。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的肺炎克雷伯氏桿菌重組菌。

本發(fā)明的第五個目的在于提供一種上述生產(chǎn)3-羥基丙酸的肺炎克雷伯氏桿菌重組菌的制備方法。

本發(fā)明的第六個目的在于提供一種上述復合啟動子或帶有復合啟動子的重組載體在提高肺炎克雷伯氏桿菌的3-羥基丙酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種復合啟動子，所述復合啟動子含有2-5個tac啟動子核心序列；

其中，當該復合啟動子含有2個tac啟動子核心序列時，序列如Seq ID No.2所示；

當該復合啟動子含有3個tac啟動子核心序列時，序列如Seq ID No.3所示；

當該復合啟動子含有4個tac啟動子核心序列時，序列如Seq ID No.4所示；

當該復合啟動子含有5個tac啟動子核心序列時，序列如Seq ID No.5所示。

本發(fā)明還提供一種重組載體，由上述的復合啟動子、puuC醛脫氫酶基因和pET-28a載體組成，其中puuC醛脫氫酶基因序列如Seq ID No.6所示；該重組載體為表達載體。

本發(fā)明還提供上述重組載體的制備方法：包括如下步驟：

1)用限制性內(nèi)切酶Bgl II/EcoR I分別對復合啟動子序列和pET-28a載體進行雙酶切；

2)電泳，瓊脂糖凝膠回收酶切后的復合啟動子片段和pET-28a載體片段；

3)使用連接酶將復合啟動子片段和pET-28a載體片段連接，得到含有復合啟動子片段的載體；