[發(fā)明專利]一種復(fù)合啟動(dòng)子及其在提高肺炎克雷伯氏桿菌的3-羥基丙酸產(chǎn)量中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810841649.4
• 申請(qǐng)日: 2018-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN108949760B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田平芳;趙鵬;馬春路
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;C12P7/42
• 代理公司: 北京北新智誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 張晶;程鳳儒

1.一種重組載體在提高肺炎克雷伯氏桿菌的3-羥基丙酸產(chǎn)量中的應(yīng)用，其特征在于，所述重組載體是含有復(fù)合啟動(dòng)子和puuC醛脫氫酶基因的pET-28a重組載體，其中復(fù)合啟動(dòng)子的序列如Seq ID No.3所示，puuC醛脫氫酶基因序列如Seq ID No.6所示；所述重組載體的制備方法如下：

1)用限制性內(nèi)切酶BglII/EcoRI分別對(duì)復(fù)合啟動(dòng)子和pET-28a載體進(jìn)行雙酶切；

2)電泳，瓊脂糖凝膠回收酶切后的復(fù)合啟動(dòng)子片段和pET-28a載體片段；

3)使用連接酶將復(fù)合啟動(dòng)子片段和pET-28a載體片段連接，得到含有復(fù)合啟動(dòng)子片段的載體；

4)PCR擴(kuò)增puuC醛脫氫酶基因序列；

5)用限制性內(nèi)切酶Sac I/EcoR I分別對(duì)步驟3)制得的含有復(fù)合啟動(dòng)子片段的載體和步驟4)制得的puuC醛脫氫酶基因進(jìn)行雙酶切；

6)電泳，瓊脂糖凝膠回收酶切后的含有復(fù)合啟動(dòng)子的載體片段和puuC醛脫氫酶基因片段；

7)使用連接酶將含有復(fù)合啟動(dòng)子的載體片段和puuC醛脫氫酶基因片段連接，得到重組載體。

2.一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，其特征在于，將含有復(fù)合啟動(dòng)子和puuC醛脫氫酶基因的pET-28a重組載體轉(zhuǎn)化至肺炎克雷伯氏桿菌，經(jīng)篩選獲得肺炎克雷伯氏桿菌重組菌，對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵，從發(fā)酵液中獲得3-羥基丙酸；

所述復(fù)合啟動(dòng)子的序列如Seq ID No.3所示，puuC醛脫氫酶基因序列如Seq ID No.6所示；

發(fā)酵時(shí)保持溫度在37℃，自動(dòng)流加酸堿使pH維持在7.0，通氣量為1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400 rpm，甘油濃度維持在20g/L以上，所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：KH₂PO₄ 2.7g/L、NH₄NO₃2.4g/L、K₂HPO₄·3H₂O 4.2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、CaCO₃ 0.15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.12g/L、NaH₂PO₄ 1.6g/L、EDTANa₂ 0.001g/L、檸檬酸0.06g/L；甘油40g/L、酵母粉4g/L、微量元素1.25mL/L，其中微量元素溶液的組成如下：Na₂MO₄·2H₂O 0.045g/L、FeSO₄·7H₂O 1.7g/L、CoCl₂·2H₂O 0.12g/L、ZnCl₂ 0.05g/L、NiCl₂·6H₂O 0.025g/L、H₃BO₃ 0.16g/L、MnCl₂·4H₂O0.1g/L、CuCl₂·2H₂O 0.06g/L、37%HCl 3.6mL。