[發明專利]使用離子交換膜層析改進下游蛋白質純化步驟的方法

在審

• 申請號: 201810818291.3
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN108892706A
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: J·J·小比爾;A·M·布朗;C·J·多德;B·E·塞耶
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 張莉;黃革生

提高用于純化蛋白質的下游層析步驟的效率的方法，其包括：(a)在包含緩沖液的操作條件下，使包含目的多肽和多種污染物的組合物通過離子交換膜，其中所述多肽和膜具有相反的電荷，所述緩沖液具有足以與所述多肽的pI區分開來以增加所述多肽的電荷的pH和有效防止緩沖液離子屏蔽電荷的低離子強度，所述操作條件導致所述膜與所述多肽以及至少一種污染物結合；(b)過載所述離子交換膜，以使所述至少一種污染物仍與膜結合，而所述目的多肽主要在流出物中；(c)從所述離子交換膜收集包含所述目的多肽的流出物；(d)使包含所述目的多肽的膜流出物進行與前述膜帶相似電荷的純化步驟，和(e)從所述帶電荷的離子交換層析純化步驟的流出物中回收純化的多肽。

本申請是申請日為2012年12月18日的、發明名稱為“使用離子交換膜層析改進下游蛋白質純化步驟的方法”的中國專利申請201280070369.9(PCT/US2012/070373)的分案申請。

發明領域

本發明一般地涉及蛋白質純化。特別地，本發明涉及通過使用上游離子交換膜層析改進下游純化步驟的性能以除去雜質的方法。

發明背景

對于生物技術產業而言，蛋白質的大規模經濟純化是日益重要的問題。通常，使用真核或原核細胞系，通過細胞培養產生蛋白質，通過插入含該蛋白質的基因的重組質粒來改造所述真核或原核細胞系以產生目的蛋白。必須使用含糖、氨基酸和生長因子的復雜生長培養基培養這些細胞，所述生長因子通常由動物血清制備物提供。從培養細胞的化合物的混合物中以及從細胞自身的副產物中分離期望的蛋白質以達到足夠用于人類治療的純度是一種艱難的挑戰。

從細胞碎片中純化蛋白質的方法最初取決于表達給定蛋白質的機制。一些蛋白質可從細胞中直接分泌到周圍的生長培養基中；其他蛋白質則在細胞內產生。對于后一種蛋白質而言，純化方法的第一個步驟涉及細胞的裂解，其可以通過多種方法完成，所述方法包括機械剪切、滲透壓休克或者酶處理。此種破壞將細胞的全部內含物釋放到勻漿中，并另外地產生了由于其體積小而難以除去的亞細胞片段。這些通常通過差速離心或者通過過濾除去。在蛋白質產生進行期間，由于細胞自然死亡而直接分泌的蛋白質以及釋放的胞內宿主細胞蛋白質造成了相同的問題，盡管量較少。

一旦獲得了含目的蛋白且沒有大細胞碎片組分的澄清溶液，通常使用不同層析技術的組合，嘗試將目的蛋白與通過細胞產生的剩余的其他蛋白質分離。這些技術基于蛋白質和其他雜質的電荷、疏水程度或大小來分離蛋白質和其他雜質的混合物。對于這些技術中的每一種，都可采用數種不同的層析樹脂，其允許精確地制定所涉及的特定蛋白質的純化方案。這些分離方法的本質是使蛋白質以不同的速率沿長的柱子向下移動，實現物理分離，該物理分離隨著它們進一步通過柱子而不斷加大，或者與分離介質選擇性粘附，然后通過不同的溶劑或置換劑差異洗脫或者置換所述蛋白質。在一些實例中，當雜質特異地與柱子粘附，并且目的蛋白不與柱子粘附時，即目的蛋白存在于“流通液”中，目的蛋白即可與雜質分離開來。涉及蛋白質純化的文獻包括Fahrner等人，Biotechnol Genet Eng Rev.2001；18:301-27。

一般用于抗體的大規模純化方法通常建立在作為初級捕獲和純化步驟的固定化A蛋白與其他柱操作組合的應用。A蛋白是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細胞壁蛋白，對IgG的Fc區具有親和力。為此，將其廣泛地用于IgG純化。A蛋白柱操作通常實現了98％以上的產物相關純度，其中在流通液級分中洗掉了大多數處理雜質(processimpurity)。然而，使用A蛋白層析存在很多缺點。首先，通常在中性至弱堿性pH進行結合，并且通常在酸性pH洗脫。一個潛在的問題是低pH可以變性或者部分變性IgG。為此以及由于臨床應用需要的高產物純度，還需要其他濃縮和純化步驟來分離產物相關的異構體以及除去殘留量的宿主細胞蛋白/DNA、細胞培養雜質、浸出的A蛋白和病毒。一個復雜的問題是這些雜質中的許多可以干擾用于分離純化的抗體的下游處理操作裝置的效率。另一主要問題是費用；A蛋白柱比常規離子交換柱貴得多。最后，當A蛋白層析不合適或者費用過高時，例如在純化多肽、抗體樣分子、抗體片段和/或純化來自某些細胞系統的完全抗體的情況下存在許多方案。