[發(fā)明專利]雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗中A、B、J亞群禽白血病病毒的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810810307.6
• 申請日: 2018-07-20
• 公開（公告）號: CN109116019A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋平;李海娟;林璐璐;王培坤;石夢雅;谷戰(zhàn)明;黃騰;磨美蘭;韋天超
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣西南寧公平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發(fā)明公開了一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗中A、B、J亞群禽白血病病毒的檢測方法，采用DMEM對商品化雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗進(jìn)行倍比稀釋后過濾，然后接種單層DF?1細(xì)胞，于5％CO₂、37℃溫箱中作用2h后更換為含1％FBS的DMEM培養(yǎng)至第6天；收集部分細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行禽白血病病毒p27群特異性抗原檢測并抽取其cDNA進(jìn)行ALV?A、B、J亞群的PCR鑒定；對陽性樣品細(xì)胞孔用亞群特異性單抗進(jìn)行IFA檢測。本發(fā)明具有具有靈敏、準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，對禽白血病的檢測及防控具有重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于禽白血病病毒檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗中A、B、J亞群禽白血病病毒的檢測方法。

背景技術(shù)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤病以及免疫抑制性疾病。ALV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、α反轉(zhuǎn)錄病毒屬，分為A-K 11個(gè)不同亞群，其中6個(gè)外源性(A、B、C、D、J、K)和1 個(gè)內(nèi)源性(E)共7個(gè)亞群可自然感染雞，其中較常見的為A、B、J亞群，K亞群為近年來從東南亞地區(qū)固有地方品種雞中發(fā)現(xiàn)的新亞群。被外源性ALV感染的雞群除誘發(fā)死亡外，臨床上多以免疫抑制、生長抑制和各器官組織出現(xiàn)腫瘤等為主要特征，對養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。

ALV的感染既可以通過垂直傳播也可以通過水平傳播。除此之外，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道接種了被外源性ALV污染的疫苗，不僅感染的雞群有可能發(fā)生相應(yīng)的腫瘤或?qū)ιa(chǎn)性能有不良影響，更嚴(yán)重的是會(huì)造成一些帶毒雞將ALV垂直傳播給后代，從而會(huì)在下一代雛雞中誘發(fā)更高的感染率和發(fā)病率。盡管目前部分大型種禽公司開展了對ALV的凈化工作并取得成效，但臨床生產(chǎn)中仍時(shí)有禽白血病的發(fā)生，而且表現(xiàn)各異，因此活疫苗中外源性禽白血病病毒的檢測對于禽白血病的凈化和防控具有極其重要的意義。

市售商品化活疫苗中A、B、J亞群禽白血病病毒的檢測方法主要是采用直接PCR的方法，但是直接PCR檢測可能出現(xiàn)擴(kuò)增出的目的片段是基因片段而不是完整的活病毒或者出現(xiàn)假陽性的情況。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種有效、準(zhǔn)確、可靠的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗中A、B、J亞群禽白血病病毒的檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗中A、B、J亞群禽白血病病毒的檢測方法，采用DMEM對商品化雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗進(jìn)行倍比稀釋后過濾，然后接種單層DF-1細(xì)胞，于5％CO₂、37℃溫箱中作用2h后更換為含1％FBS的DMEM培養(yǎng)至第6 天；收集部分細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行禽白血病病毒p27群特異性抗原檢測并抽取其cDNA進(jìn)行ALV-A、B、J亞群的PCR鑒定；對陽性樣品細(xì)胞孔用亞群特異性單抗進(jìn)行IFA檢測。

上述檢測方法，按以下步驟操作進(jìn)行：

(1)無菌條件下將2mL DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)加入商品化雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗中，對其進(jìn)行溶解；

(2)將溶解的疫苗使用商品化DMEM進(jìn)行倍比稀釋，稀釋比例分別為1∶2、1∶4、1∶ 8、1∶16、1∶32、1∶64，將疫苗的各稀釋液用直徑為0.22μm的一次性過濾器(JET BIOFIL 公司)過濾去除雜質(zhì)以及減少部分粒子較大的病毒(ALV、IBV、NDV直徑依次為80-145nm、 120nm、100～500nm)后，取100μL接種于長成80％左右的單層DF-1細(xì)胞，2h后更換成含1％FBS的DMEM維持培養(yǎng)6天，通過觀察細(xì)胞的生長狀況，篩選出疫苗的最佳稀釋比例為1∶8，然后進(jìn)行A、B、J亞群禽白血病病毒檢測；