[發明專利]一種含有FLAG蛋白融合標簽的植物表達質粒載體及其載體的構建方法

在審

• 申請號: 201810798051.1
• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108913715A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 江文波;龐永珍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 黃玉玨

1.一種含有FLAG蛋白融合標簽的植物表達質粒載體，其特征在于，該載體為在植物表達質粒載體的C端含有FLAG蛋白融合標簽的植物表達質粒載體。

2.根據權利要求1所述的含有FLAG蛋白融合標簽的植物表達質粒載體，其特征在于，該載體包含有三段編碼FLAG蛋白標簽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因片段，所述三個FLAG蛋白的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。

3.根據權利要求1所述的含有FLAG蛋白融合標簽的植物表達質粒載體，其特征在于，該載體的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一種構建權利要求1-3任意一項所述含有FLAG蛋白融合標簽的植物表達質粒載體的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)以pCAMBIA1302為出發質粒，采用SpeI和Eco065I酶切該質粒，通過凝膠電泳切膠回收9802bp的片段；

(2)全序列合成包含編碼3個FLAG蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含編碼3個FLAG蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

(3)設計用于擴增包含編碼3個FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的擴增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase進行擴增反應，擴增體系：50微升的總體積，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩爾上游引物、2.5微升的10微摩爾下游引物、1微升的上述合成的包含編碼3個FLAG蛋白、濃度為45納克/微升核苷酸序列基因片段、32.5微升的超純水和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；擴增程序：98℃運行30秒；然后30個循環的：98℃運行10秒；60℃運行30秒；72℃運行10秒；最后72℃運行10分鐘；

(4)擴增后最終在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位點，在C端加上Eco065I酶切位點；用SpeI和Eco065I酶切該合成片段，凝膠電泳后切膠回收該片段；最后利用T4DNA連接酶連接上述酶切后回收純化的片段；將連接反應的產物，熱激轉化DH5α,通過PCR鑒定得到陽性克隆；質粒載體的序列通過測序驗證。