[發(fā)明專利]一種由羊白蛋白、羊干擾素γ和羊干擾素τ組成的融合蛋白及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810768491.2
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN108864305A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐文俊;郭志燕;夏兵兵;何志遠(yuǎn);鮑可兵;劉家爐;蔣敏之
• 申請（專利權(quán)）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61P31/12;A61P37/04
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34107
• 代理人: 尹婷婷

本發(fā)明公開了一種由羊白蛋白、羊干擾素γ和羊干擾素τ組成的融合蛋白及其制備方法，所述融合蛋白由羊白蛋白、羊干擾素γ和羊干擾素τ經(jīng)柔性linker連接而形成，融合蛋白與凍干保護(hù)劑混配后經(jīng)冷凍干燥即可得到重組羊長效干擾素。所述重組羊長效干擾素可顯著提高羊干擾素的半衰期，較普通羊干擾素的半衰期提高17倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高羊自身的免疫應(yīng)答。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及由羊白蛋白、羊干擾素γ和羊干擾素τ組成的融合蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)

由病毒引起的動物傳染性疾病嚴(yán)重制約了各個國家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，中國是世界上羊存欄量、出欄量、羊肉產(chǎn)量最多的國家，肉羊產(chǎn)業(yè)也是我國畜牧業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著羊養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，不可避免的要面對病毒引起的疾病的問題，畜類疾病不僅給羊養(yǎng)殖者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，更為嚴(yán)重的是，一些人獸共患傳染性疾病還給人類健康帶來潛在威脅。

目前羊類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復(fù)雜，毒株變異快，常導(dǎo)致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前尚無疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人類的健康。

常用的藥物治療主要采用抗生素進(jìn)行治療，但是近年來由于抗生素的廣泛和大量使用，導(dǎo)致耐藥性菌株大量產(chǎn)生，并通過食物鏈傳染給人，給人類健康帶來更大的威脅。現(xiàn)在一些國家己明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。因此，使用干擾素來積極治療和預(yù)防家畜、家禽的病毒性疾病將是人類最為關(guān)注的問題。

IFN是一類病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖以及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。

干擾素τ(interferon tau，IFN-τ)最初被稱為滋養(yǎng)層蛋白，由滋養(yǎng)層分泌的一類新型的I型IFN，是反芻動物母體妊娠識別的孕體信號，在黃體維持和妊娠建立過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。干擾素-τ具有Ⅰ型干擾素的共同特性:具有抗病毒、抗細(xì)胞增生、免疫調(diào)節(jié)等功能。IFN-τ在生物學(xué)功能方面有自身特點，它僅在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，無需病毒誘導(dǎo)，而且比IFN-τ/β更少的細(xì)胞毒性。基于其特有的生物學(xué)活性及低細(xì)胞毒性，為許多疾病的治療帶來新的希望。

γ型IFN是由激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，所以IFN-γ又稱為免疫調(diào)節(jié)干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導(dǎo)細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)，但干擾素γ的免疫調(diào)節(jié)活性在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和確定機(jī)體長期的抗病毒狀態(tài)中發(fā)揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應(yīng)用價值。

血清白蛋白是血漿的重要成分，正常情況下不易透過腎小球，體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是理想的藥物載體。白蛋白融合技術(shù)有以下優(yōu)點：白蛋白與目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵鏈接，不需額外的體外處理；白蛋白的表達(dá)水平較高，與其融合后可以提高目的蛋白的表達(dá)水平；白蛋白是一個穩(wěn)定的“惰性蛋白”，與其融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性；白蛋白融合蛋白具有較長的藥物半衰期，將小分子蛋白藥物與白蛋白融合可有望提高在血液中的半衰期。目前，多種蛋白與白蛋白融合后在實驗動物體內(nèi)半衰期的延長得到了證實。

天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數(shù)的增加，相應(yīng)的時間成本及經(jīng)濟(jì)成本隨之增加，而機(jī)體的耐受極限也有可能被突破導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內(nèi)代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統(tǒng)清除。

而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導(dǎo)致半衰期短的問題，同時聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于臨床上應(yīng)用。