[發明專利]一種通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法

在審

• 申請號: 201810759269.6
• 申請日: 2018-07-11
• 公開（公告）號: CN108949979A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 溫媛;周衍慶;陳實富;張實唯
• 申請（專利權）人: 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 陳劍聰

1.一種通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，其是使用cfDNA多基因變異結合機器學習來判定，包括如下步驟：

S1.對肺結節患者外周血cfDNA進行文庫構建；

S2.采用肺癌相關18個基因捕獲探針對cfDNA進行雜交捕獲，該18個基因分別為STAT3、DDR2、STAT3、ERBB3、SOD2、RAF1、ERBB4、AKT1、SLIT1、NTRK1、DDR2、KEAP1、NOTCH1、TSC2、JAK2、JAK2、EGFR和ATM；

S3.使用測序儀進行測序，對測序數據進行數據分析，分析每個基因的累計突變頻率，使用邏輯回歸的模型判斷樣本的良惡性。

2.根據權利要求1所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S1中，對cfDNA進行文庫構建，具體包括如下步驟：

S11.提取外周血血漿中的游離的DNA，并對提取的cfDNA進行質量控制，測定其片段大小和濃度，片段大小峰值位于40-170bp，DNA起始量在5-25ng之間；

S12.然后依次對提取的cfDNA進行雙鏈末端修復、樣品純化、3′末端加T、連接接頭、PCR擴增富集，

S13.最后對所述PCR擴增富集的產物進行PCR產物純化，即獲得cfDNA文庫。

3.根據權利要求2所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S12的樣品純化以及S13的PCR產物純化都采用磁珠吸附法進行。

4.根據權利要求1所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S2中捕獲探針的3′端具有生物素標記，基因捕獲探針采用覆瓦式探針，探針長度120bp。

5.根據權利要求1所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S2中，在雜交捕獲中，按照一個探針捕獲10-12個cfDNA文庫的用量添加捕獲探針。

6.根據權利要求1所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S3中，使用第二代高通量測序儀Illumina NextSeq550對樣本進行測序，18個基因目標區域cfDNA測序深度達到10000X。

7.根據權利要求1所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S3中，數據分析包括使用afterQC去除低質量數據，bwa進行數據比對，使用dedup軟件去除PCR重復，samtools+VarScan2進行變異檢測，然后使用MrBam統計每個變異位點比對唯一讀段數量，過濾唯一讀段小于2的變異，使用正常人baseline數據庫過濾正常人中出現的體細胞變異。

8.根據權利要求1所述的通過血液樣本判斷肺結節良惡性的方法，其特征在于，S3中，使用邏輯回歸的模型是通過公式log(p/(1-p))＝b0+b1*x1+b2*x2+…+bn*xn計算，得到在給定基因突變頻率(x1,x2,…xn)時，樣本為惡性的概率p；當p>0.5時判定樣本為惡性，其余判定樣本為良性。