[發明專利]一種表達細粒棘球蚴EG95蛋白的重組羊痘病毒在審
| 申請號： | 201810758404.5 | 申請日： | 2018-07-11 |
| 公開（公告）號： | CN108866097A | 公開（公告）日： | 2018-11-23 |
| 發明（設計）人： | 劉拂曉;王志亮;吳曉東 | 申請（專利權）人： | 中國動物衛生與流行病學中心 |
| 主分類號： | C12N15/863 | 分類號： | C12N15/863;C12N15/65 |
| 代理公司： | 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 湯東鳳 |
| 地址： | 266032 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 轉移載體 篩選標記基因 轉錄終止信號 開放閱讀框 細粒棘球蚴 親本病毒 篩選標記 羊痘病毒 重組病毒 啟動子 同源臂 蛋白 篩選 上游 基因 引入 污染 | ||
1.一種用于重組山羊痘病毒構建的轉移載體，其特征在于，所述的轉移載體包含有TK基因的左臂TKL和右臂TKR，EG95基因；增強型綠色熒光蛋白eGFP和大腸桿菌gpt兩個篩選標記基因，且該轉移載體攜帶氨芐青霉素抗性基因。
2.如權利要求1所述的轉移載體，其特征在于，所述的EG95基因開放閱讀框的上游為p7.5K啟動子，下游為ATTTTTAT早期轉錄終止信號。
3.如權利要求1所述的轉移載體，其特征在于，所述的eGFP和gpt篩選標記分別受p11K和p7.5K啟動子轉錄調控。
4.如權利要求1所述的轉移載體，其特征在于，所述的轉移載體的核苷酸序列為SEQ IDNO:1。
5.權利要求1所述的轉移載體在制備表達細粒棘球蚴EG95蛋白的重組羊痘病毒中的應用。
6.一種制備表達細粒棘球蚴EG95蛋白的重組羊痘病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟：
制備山羊睪丸上皮細胞，培養至80－90％致密單層，接種山羊痘病毒，37℃進行病毒孵育，按照每孔加150uL無血清OPTI-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例配制溶液I，溫柔混勻，再按照每孔加入150uL無血清OPTI-MEM和3μg權利要求1所述的轉移載體配制溶液II，然后將溶液II逐滴加入溶液I中，溫柔混勻，室溫放置20min；在此期間，吸棄六孔板內病毒液，每孔加入1mL OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂質體-DNA混合液；37℃5％CO2培養箱培養6h，吸棄轉染液，加入細胞維持液，37℃5％CO2培養箱培養72-96h；轉染后24h篩選重組羊痘病毒。
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