[發(fā)明專利]用于定量檢測EB病毒核酸的數字PCR試劑盒及檢測方法

在審

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• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN110684863A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設計）人: 嚴曉鋒;劉鳳麟;熊慧
• 申請（專利權）人: 蘇州云泰生物醫(yī)藥科技有限公司;武漢百泰基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 11390 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 胡劍輝

本發(fā)明屬于病毒核酸檢測領域，具體涉及一種用于定量檢測EB病毒核酸的數字PCR試劑盒及檢測方法。本發(fā)明試劑盒含有數字PCR反應液和質控品；數字PCR反應液中含有用于檢測EB病毒核酸的引物和探針，包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探針；探針的兩端標記有熒光基團。本發(fā)明的試劑盒及檢測方法可實現對核酸分子的絕對定量，從而避免了由PCR擴增效率差異所導致的偏差，具有更高的精確度、靈敏性和重復性，易于標準化。

技術領域

本發(fā)明屬于病毒核酸檢測領域，具體涉及一種用于定量檢測EB病毒核酸的數字PCR試劑盒及檢測方法。

背景技術

人類是EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)惟一天然宿主，EB病毒的全世界人感染率超過90％。原發(fā)感染通常發(fā)生在幼年時期，并且無癥狀，表現為隱性感染；但如果感染發(fā)生在青少年或成年，則可能導致感染性單核細胞增多癥。據報道，我國95％以上人群在3～5歲時已感染了EBV。原發(fā)感染后，病毒可以長期持續(xù)性存在，呈潛伏感染狀態(tài)，在大多數病例中無癥狀。EB病毒主要經唾液傳播，但也有報道經血液和性活動傳播。EB病毒感染細胞有兩種形式：即潛伏性感染和增殖性感染。在潛伏性感染中，病毒以環(huán)狀游離體和/或整合型形式存在。在一定條件下，如免疫功能低下或某些物理化學因素的作用(紫外線、丁酸、巴豆油及尿嘧啶等)，EB病毒可以從潛伏狀態(tài)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)。

我國是鼻咽癌的高發(fā)國家，其發(fā)病率占頭頸部腫瘤的首位。已有大量的實驗研究表明，EB病毒與鼻咽癌關聯(lián)密切，放療前血漿EBVDNA檢測對NPC的臨床分期和判斷預后有重要的臨床意義，放療結束時血漿EBV DNA檢測對殘留病灶和總生存判斷同樣具有重要意義，并對放療后腫瘤轉移復發(fā)有監(jiān)測作用。傳統(tǒng)的EB病毒相關抗體的檢測是診斷及監(jiān)測患者病情最常用的方法，但是它的敏感性和特異性較差。目前的熒光定量PCR對原有核酸只能進行相對定量,需要依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，且對病毒是否為陽性的檢測存在不確定的檢測結果，導致多次檢測，或者檢測結果不準確。ddPCR技術的引入為直接和真實地反映患者體內病毒復制水平，為我們在腫瘤的診斷、治療和判斷預后方面提供了一種新的非侵入性手段。

數字PCR技術是近年興起的第三代PCR絕對定量技術，與實時熒光定量PCR技術相比，數字PCR不依賴于擴增曲線的閾值(C_T)進行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用標準曲線，具有很好的準確度和重現性，可以實現絕對定量分析。在現階段的低豐度因子檢測中，實時熒光定量PCR技術都因受到背景DNA或雜質的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精準定量的要求，而數字PCR檢測系統(tǒng)通過微滴化處理，使得稀有檢測片段從大量的復雜背景中分離出來，從而提高檢測的靈敏度和精確性。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于提出一種用于定量檢測EB病毒核酸的數字PCR試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明的又一發(fā)明目的在于提出一種采用數字PCR檢測EB病毒核酸的引物和探針。

為了完成本發(fā)明的目的，采用的技術方案為：

本發(fā)明涉及一種用于定量檢測EB病毒核酸的數字PCR試劑盒，所述試劑盒含有數字PCR反應液和質控品；所述數字PCR反應液中含有用于檢測EB病毒核酸的引物和探針，所述用于檢測EB病毒核酸的引物和探針包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探針；所述探針的兩端標記有熒光基團。

可選的，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有BHQ。

可選的，所述數字PCR反應液中還含有數字PCR緩沖液。