[發明專利]厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶--一種新型的海洋污染檢測標記物

在審

• 申請號: 201810737728.0
• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN108913670A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 郭寶英;葉瑩瑩;劉碩博
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/53;C12Q1/6888
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶基因，其特征在于：所述谷胱甘肽過氧化物酶基因為克隆基因，通過基因克隆技術獲得。

2.權利要求1所述的厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶基因，其克隆方法的包括總RNA提取、cDNA第一鏈的合成、過氧化物酶基因核心片段PCR擴增、過氧化物酶基因RACE擴增全長、篩選、生物信息學分析，其特征在于：所述過氧化物酶基因核心片段PCR擴用引物為：GPx-REAL-F1:5’-GTTAGAGGCCGAGCTGAAGC-3’；GPx-REAL-R1:5’-GTTGTAACTTTTCAGGTAGT-3’。

3.根據權利要求2所述的厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶基因，其特征在于：所述克隆方法具體包括如下步驟：

1）總RNA提取：以厚殼貽貝作為材料，提取各組織總RNA；

2）cDNA第一鏈的合成：以步驟1獲得的總RNA樣品作為模板，使用M-MLV反轉錄試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得cDNA第一鏈；

3）基因核心片段PCR擴增：根據NCBI數據庫中谷胱甘肽過氧化物酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守區，使用primer5.0軟件設計簡并引物從而PCR擴增出谷胱甘肽過氧化物酶的基因核心序列，對存在目的條帶的PCR產物進行純化回收，備用；

4）RACE擴增全長：基于步驟3獲得的基因序列，根據所得的目的序列進行了RACE引物的設計，利用RACE技術擴增得到5’端和3’端序列以及ORF區的驗證序列；

5）篩選：將步驟4獲得的RACE反應產物連接至PMD18-T載體并轉至DH5&感受態細胞中，涂板后挑取單克隆培養，菌液PCR驗證后進行序列測定，獲得谷胱甘肽過氧化物酶基因序列；

6）生物信息學分析：將步驟5獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件進行氨基酸序列的翻譯，獲得對應蛋白質的氨基酸序列生物信息學分析。

4. 根據權利要求3所述的厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶基因的克隆方法，其特征在于：所述總RNA提取用混合裂解液，所述500ul混合裂解液含有490ul Trizol、5ul 4-喹啉醇和5ul DL-泛醇。

5. 根據權利要求2所述的厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶，其特征在于：所述PCR反應體系總體積25.0μl，其中ddH₂O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl₂ 2.5μl、2.5mMdNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。

6.根據權利要求2所述的厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶，其特征在于：所述PCR反應的程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物。

7.一種利用權利要求1至6任一項所述的厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶用作新型海洋生物污染檢測標記物，其特征在于：用厚殼貽貝作為檢測海洋污染的生物樣本，厚殼貽貝谷胱甘肽過氧化物酶基因用作海洋污染的檢測標記物。

8.一種利用權利要求7所述的一種新型海洋生物污染檢測標記物檢測海洋生物污染的方法，其特征在于：通過對受到污染區域厚殼貽貝的解刨提取消化腺中的RNA，反轉錄成DNA，再利用熒光定量技術檢測厚貝谷胱甘肽過氧化物酶基因在消化腺中的相對表達量，即可。