[發明專利]一種快速檢測黃牛ACTL8基因SNP的RFLP方法

在審

• 申請號: 201810736273.0
• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN108893545A
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 陳宏;蔡翠翠;黃永震;馬云;藍賢勇;雷初朝;白躍宇
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/683
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

本發明公開了一種快速檢測黃牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，包括以下步驟：該方法是以黃牛全基因組DNA為模板，利用1對PCR引物，在PCR條件下進行擴增，然后利用限制性內切酶消化PCR擴增產物，再對酶切后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳對其進行片段大小分離，從而確定其SNP。本發明是一種在DNA水平上篩檢與黃牛生產性狀密切相關的分子遺傳標記，可用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇，該方法操作簡單、快速，成本低，而且檢測的精確度高，便于推廣應用。

技術領域

本發明屬于分子遺傳學技術領域，涉及一種快速檢測黃牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，具體地說，涉及一種快速檢測肌動蛋白樣蛋白8(Actin-like 8，ACTL8)基因單核苷酸多態性(SNP)的限制性片段長度多態性(RFLP)方法。

背景技術

所謂單核苷酸多態性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。SNP屬于第三代分子標記，具有密度高、雙等位基因、易實現自動化檢測等優點。由于SNP具有其它標記無法比擬的優點，所以它作為一種研究工具已經在生命科學的各個領域得到廣泛應用。

目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs：DNA序列測定方法、PCR-SSCP(單鏈構型多態性)與DNA測序相結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應、PCR-RFLP方法等。在這些SNP檢測技術中，①DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；②當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陰性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；③AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，不具有普遍應用的特點；④引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。綜上所述，現有方法不是一種檢測具有限制性酶切位點SNP的理想的遺傳標記方法。

ACTL8基因在肌肉生長發育和細胞骨架中所發揮的生物學功能極為重要，對肌細胞運動、信號傳遞、物質運輸等活動起主導作用。該基因多態與牛體重、體高、十字部高、體斜長等性狀存在顯著相關(P<0.05)。國內外尚無黃牛ACTL8基因遺傳變異及其與生長性狀關系的研究報道。由于目前中國黃牛ACTL8基因遺傳變異領域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與生長性狀(如：尻長、坐骨端寬和胸圍等性狀)關聯的研究成為空白。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速檢測黃牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，是一種利用限制性內切酶對包含該單核苷酸多態性位點的基因序列進行酶切，根據瓊脂糖凝膠電泳對其進行片段大小分離，利用凝膠成像系統分析其片段大小，從而確定其SNP。

其具體技術方案為：

一種快速檢測黃牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，包括以下步驟：

以黃牛血液全基因組DNA為模板，在2×Taq PCR MasterMix存在的情況下，利用1對PCR(聚合酶鏈式反應)引物，在PCR條件下進行擴增，然后利用限制性內切酶對其進行酶切，再通過電泳檢測即可鑒定黃牛ACTL8基因外顯子區SNP。

進一步，所述的PCR擴增1對PCR引物包括：

上游引物Forward primer:5'-CCTGGCTCTTCCTGATCCTC-3'和下游引物Reverseprimer:5'-TCCTCCTTCGTCAGCCACTC-3'；