[發明專利]miRNA-340靶基因結合序列、重組質粒及其應用

有效

• 申請號: 201810706843.1
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108998451B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發明（設計）人: 阮慶國;邊江;劉芮伶;王紹文;耿雯雯
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N1/19;C12N5/10;C12N15/66;C12Q1/6876
• 代理公司: 深圳中一聯合知識產權代理有限公司 44414
• 代理人: 李艷麗

本發明涉及分子生物學和基因表達調控技術領域，具體涉及一種miRNA?340靶基因結合序列、重組質粒及其應用，該序列包括：SEQIDNO：1、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：19所示的核苷酸序列。本發明的miRNA?340靶基因結合序列能夠與miRNA?340結合，其構建的重組質粒能夠快速、靈敏、簡便地鑒定目標microRNA是否結合IL?17A 3’UTR調控片段從而起調控作用。

技術領域

本發明涉及分子生物學和基因表達調控技術領域，具體涉及一種miRNA-340靶基因結合序列、重組質粒及其應用。

背景技術

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類僅有18～25個核苷酸的單鏈小分子RNA，廣泛存在于線蟲、果蠅、植物和包括人在內的真核生物中,具有高度的保守性、組織特異性和時序性的非編碼RNA分子，不具有開放閱讀框(open reading frame)。microRNA的基因位于遺傳編碼基因的內含子中,也有一部分存在與基因間DNA序列中,形成成熟的microRNA后發揮調控轉錄后作用。可通過與靶基因的3’端非編碼區域(3’UTR)互補配對，在轉錄后水平對靶基因進行負調控，導致mRNA翻譯抑制或者降解，在胚胎發育、細胞分化、凋亡、腫瘤形成等方面發揮著多元化調控作用。

已有研究報道，miRNA-340在腫瘤的發病機制中起到非常重要的作用，并在不同類型的腫瘤研究中，發揮致癌或抑癌的調節作用，通過抑制相關致癌基因包括p-AKT、EZH2、表皮生長因子受體等，或通過靶向相關基因抑制肝癌、肺癌、結腸癌、胃癌，乳腺癌等發揮抑癌癥作用。同時，miRNA-340也可能調節免疫細胞的分化與功能。有研究發現，miRNA-340可通過下調IL-4、Bmi-1等基因靶點來抑制Th2細胞分化，使實驗性變態反應性腦脊髓炎(EAE)中的Th2細胞向Th1細胞亞群偏移。進一步了解，miRNA-340抑制Th2通路可促進Th1、Th17細胞的分化，但是否直接靶向IL-17A影響Th17細胞，尚未有研究報道。臨床上多發性硬化根據病程特點分為復發-緩解型、繼發進展型和原發進展型，有研究發現，從前2種分型患者外周血中分離的記憶性T細胞高度表達miRNA-340，但在原發進展型患者中表達未見明顯變化，甚至在活動性硬化斑中有降低現象；同時過表達髓磷脂特異性T細胞中miRNA-340、miRNA-27、miRNA-128可加重小鼠EAE表型。

根據miRBase數據庫，目前所發現的miRNAs已超過700個，隨著高通量測序的應用，將會有更多的新的miRNAs被發現。可能近90％的人類基因受到miRNAs調控，然而，當過表達或抑制某一個miRNA時，在發生調變的眾多基因當中尋找并鑒定其中起關鍵作用的靶基因仍然具有相當大的挑戰。目前鑒定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息學軟件預測，主要根據已證實的miRNA及其靶基因序列之間相互作用的規律性，遵循幾個常用原則設計的軟件完成,如miRanda,TargetScan和TargetScanS,RNAhybrid,DIANA-microT,PicTar,及FindTar等。此外，利用蛋白質質譜來尋找miRNA靶基因也成為一種新的途徑。

由于計算機模擬在預測miRNA靶基因時存在一定的局限性，利用生物學實驗方法可以更加直觀地尋找miRNA靶基因。目前主要是從mRNA水平與蛋白質水平來尋找靶基因。從mRNA水平來尋找靶基因主要是通來在細胞內過表達miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應miRNA的靶基因。這種方法由于miRNA所介導的轉錄后翻譯抑制過程不引起mRNA水平的改變，因此依據mRNA水平的變化尋找miRNA靶基因的方法在檢出率上存在一定問題。