[發明專利]一種肝癌標志物GP73檢測探針的制備及應用

在審

• 申請號: 201810689801.1
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN109254152A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 趙永祥;周素芳;張坤;黃勇;陽諾
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 韋肖燕

1.一種肝癌標志物GP73檢測探針的制備，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：

1）納米金的合成

在 500 mL 三口燒瓶中加入 250 mL水，再加入 2.5 mL 1% HAuCl4，在電爐上加熱至沸騰后，快速加入 4.4 mL 1%檸檬酸鈉，溶液在 2~3 min 內其顏色由淡黃色—藍色—酒紅色逐漸變化，然后繼續保持沸騰 10~15 min，移走熱源，在室溫下繼續攪拌至冷卻，最后定容到 200 mL，制得納米金顆粒的直徑為 13 nm，置 4 ℃冰箱冷藏備用；

2）探針的合成

（1）用0.1M的K2CO3溶液將10 mL的新鮮合成的AuNPs的pH調至9.0；

（2）取HRP酶標記的GP73抗體30μL并用適量的超純水稀釋后，在不斷攪拌下逐滴加入到納米金溶液中，并于室溫下靜置1小時；

（3）1 h后，在攪拌下逐滴加入BSA水溶液，使反應體系中BSA的最終濃度達到1%，然后在高速離心機中13500 rpm 離心20 min, 棄上清；

（4）用含1%BSA和0.05%NaN₃的PB：pH 7.4洗滌，再以13500 rpm 離心20 min，棄上清，如此反復洗滌兩次；

（5）將洗滌后的離心沉淀物用5 mL含5%BSA和0.05%NaN₃的PB：pH 7.4重懸，重懸后，經1000 rpm 離心5 min，棄下層沉淀物，置 4℃冰箱保存；

3） GP73檢測步驟

（1）包被：用包被緩沖液pH 9.6將凍干的GP73抗體溶解稀釋至2.5μg/mL，酶標板每孔加100μL 4 ℃過夜，至次日用洗滌液200μL至微量震蕩器洗3次，每次3min；

（2）封閉：在酶標板的每孔加入250μL新鮮配好的封閉液1% BSA，并置于恒溫培養箱中37℃孵育2h；2h后用洗滌液200μL至微量震蕩器洗滌；

（3）加樣：加入待測樣品—稀釋血清100μL于上述已包被的孔中，并置于恒溫培養箱中37℃孵育1h，1h后用洗滌液200μL至微量震蕩器洗滌；

（4）加檢測探針：預先備好稀釋的檢測探針，然后將新鮮稀釋的檢測探針100μL加入反應孔中，恒溫培養箱中37 ℃孵育45min，然后用洗滌液200μL至微量震蕩器洗滌；

（5）顯色：在上述各反應孔中加入100μL TMB底物顯色試劑，恒溫培養箱中37 ℃閉光孵育20 min；

（6）終止反應：于上述各反應孔中加入100μL終止液；

（7）結果判定：于酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

2.根據權利要求1所述肝癌標志物GP73檢測探針的制備，其特征在于：所述酶標GP73抗體與納米金合成的比例是：5μL~30μL：10mL。

3.根據權利要求1或2所述肝癌標志物GP73檢測探針的制備，其特征在于：所述GP73抗體修飾納米金的探針應用于檢測腫瘤標志物GP73。