[發明專利]利用RT-RPA方法快速檢測植株中水稻黑條矮縮病毒

有效

• 申請號: 201810626250.4
• 申請日: 2018-06-13
• 公開（公告）號: CN108753928B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 孫楓;趙沖;李雪娟
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11
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本發明提供了一種RT?RPA快速檢測植株中水稻黑條矮縮病毒的方法及其在病害診斷上的應用。利用這一方法可以快速鑒定出水稻黑條矮縮樣品，進而采取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。

技術領域：

本發明涉及植株中水稻黑條矮縮病毒的快速檢測技術及其在病害診斷和測報上的應用，屬于農業科學技術領域。

背景技術：

水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)。水稻黑條矮縮病首次報道在1963年中國江蘇、浙江、上海等地的水稻種植地區大面積爆發，之后造成小麥和玉米的普遍發病，曾造成江南地區水稻的幾乎絕收。近幾年，RBSDV在江蘇、河南、浙江和江蘇的水稻產區呈現爆發流行趨勢。該病毒主要侵染水稻、玉米、和小麥等植物，侵染水稻引起水稻黑條矮縮病。感病植株表現為秧苗暗綠、葉片稍短且僵直、葉背基部常有淺綠至蠟白色的短條狀脈腫，分蘗期病狀更為明顯，拔節至孕穗期，病株明顯矮縮，病葉暗綠，病株一般不能正常抽穗或很少結實。發病田區減產明顯，嚴重時甚至會造成顆粒無收。RBSDV侵染小麥時，造成小麥的綠矮病，癥狀與水稻相似；侵染玉米，造成玉米的粗縮病，發病植株有明顯的粗縮、形如姜叢、葉色暗綠、葉片短直等癥狀。

目前植物病毒鑒定常用的方法有：生物學接種實驗、血清學檢測、電鏡觀察及分子生物學方法。這些方法大都需要特定儀器且耗時久，不適用于田間快速檢測。重組聚合酶擴增法技術(recombinase polymerase amplification，RPA)是由Piepenburget等在2006年發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，是一種高靈敏鏈置換技術，一種新型PCR替代技術。RPA特點是針對靶基因的1個區域設計2條特異引物和1條特異性探針，利用重組酶(recombinases)、單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA-binding protein)和鏈置換聚合酶(strand-displacing polymerase)在恒溫(37℃)的條件下反應20min左右即可完成核酸擴增反應。通過快速檢測試紙條(橫向流動技術)檢測RPA反應產物，直接得到清晰的反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要PCR儀等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷中。

發明內容：

本發明提供了一種快速檢測植株中水稻黑條矮縮病毒的方法，通過該方法可以快速診斷出植株是否攜帶該病毒。

本發明所提供的一種快速檢測植株中水稻黑條矮縮病毒的方法，通過以下方法獲得：

1)根據NCBI已報道水稻黑條矮縮病毒P10核苷酸序列(NC_003733.1)，通過軟件DNAstar分析后選擇相對保守區域300-600bp，利用在線引物設計軟件Primer blast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)設計3條引物，其中包括2條引物P10-RPA-F/P10-RPA-R和1條探針P10-probe；

2)Trizol reagent提取植株總RNA；

3)利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑，將RNA反轉錄成cDNA；

4)設置不同cDNA模板稀釋濃度、反應時間、反應溫度，確定最佳RT-RPA反應體系；

5)與RT-PCR方法進行比較，驗證RT-RPA方法的可靠性；

本發明提供的引物序列如下：

P10-RPA-F CGAACAACGACCTAAGTGAAGAATTTGTAG