[發(fā)明專(zhuān)利]一種具有大斯托克斯位移的重組熒光蛋白質(zhì)及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810600293.5
• 申請(qǐng)日: 2018-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108841846B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳華新;姜鵬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C07K14/795
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

本發(fā)明屬于生物技術(shù)中熒光蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種具有大斯托克斯位移的重組藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)及其制備方法。利用基因工程方法，將藻膽蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT，藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB，血紅素氧化酶基因Ho1和藻紅膽素還原酶基因pebS導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的合成途徑，制備具有大斯托克斯位移的重組熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明是利用生物技術(shù)方法在大腸桿菌體內(nèi)生產(chǎn)熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好、成本低的制備方法。該熒光蛋白質(zhì)可用于熒光檢測(cè)等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)中熒光蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種具有大斯托克斯位移的重組藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)及其制備方法。

背景技術(shù)

藻膽蛋白是藻類(lèi)重要的色素蛋白，具有光能捕獲和傳遞的作用。每分子的藻膽蛋白含有兩條結(jié)構(gòu)相似的多肽鏈α和β，α亞基和β亞基分別含有約160～180個(gè)氨基酸殘基，二者的比例通常為1:1。亞基中的半胱氨酸殘基通過(guò)硫醚鍵與藻膽色素共價(jià)結(jié)合，藻膽色素的種類(lèi)及其與脫輔基蛋白的相互作用決定了藻膽蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)。根據(jù)吸收光譜的不同，可將藻膽蛋白分為4大類(lèi)：即藻紅蛋白PE,λ_max＝540nm～570nm，藻紅藍(lán)蛋白PEC，λ_max＝567nm，藻藍(lán)蛋白PC，λ_max＝615nm～640nm和別藻藍(lán)蛋白APC，λ_max＝650nm～655nm。藻膽蛋白具有強(qiáng)烈的熒光特性，已廣泛應(yīng)用于流式細(xì)胞分析和免疫熒光檢測(cè)等領(lǐng)域。

近年來(lái)，隨著藻膽蛋白生物合成途徑的闡明，以及合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在大腸桿菌中人工構(gòu)建完整藻膽蛋白(含蛋白亞基和色基)的生物合成途徑。通過(guò)工程菌規(guī)模化發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)藻膽蛋白在大腸桿菌中的生物合成與組裝，然后通過(guò)親和層析純化制備重組藻膽蛋白。Tooley等人在國(guó)際上率先實(shí)現(xiàn)了藻藍(lán)蛋白α亞基(2001年)和藻紅藍(lán)蛋白α亞基(2002年)在大腸桿菌中藻膽蛋白的組合生物表達(dá)，為藻膽蛋白的制備提供了一條全新的途徑。在國(guó)內(nèi)，本專(zhuān)利發(fā)明人在藻膽蛋白的組合生物表達(dá)，藻膽蛋白的分子進(jìn)化以及新型人工藻膽蛋白熒光探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)和構(gòu)建方面，展開(kāi)了系統(tǒng)性的研究工作，已實(shí)現(xiàn)多種藻膽蛋白亞基與多聚體在大腸桿菌中的生物合成與組裝，通過(guò)蛋白分離純化技術(shù)獲得的重組藻膽蛋白，具有與天然藻膽蛋白相似的光譜學(xué)性質(zhì)。此外，通過(guò)鏈霉親和素和藻膽蛋白的融合表達(dá)，獲得了同時(shí)具有生物素結(jié)合能力和熒光特性的融合藻膽蛋白熒光探針?lè)肿印?/p>

通過(guò)基因工程方法獲得重組藻膽蛋白，具有快速高效、成本較低、不受季節(jié)氣候影響等突出優(yōu)勢(shì)。但是，目前重組合成的藻膽蛋白熒光蛋白質(zhì)普遍存在的問(wèn)題是重組藻膽蛋白只結(jié)合一個(gè)藻膽色素分子，其斯托克斯位移較小，通常為10-25nm。由于激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光檢測(cè)波長(zhǎng)接近，激發(fā)光容易對(duì)熒光檢測(cè)造成干擾。而較大的斯托克斯位移，不僅可以增加熒光檢測(cè)的信噪比，而且可以降低熒光蛋白質(zhì)分子的自猝滅作用。本發(fā)明提供一種具有大斯托克斯位移的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種具有大斯托克斯位移的重組藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)及其制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種大腸桿菌中具有大斯托克斯位移的重組藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法：利用基因工程方法，將藻膽蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT，藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB，血紅素氧化酶基因Ho1和藻紅膽素還原酶基因pebS導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的合成途徑，制備具有大斯托克斯位移的重組熒光蛋白質(zhì)。

具體為：

1)利用基因工程方法，將藻膽蛋白裂合酶基因cpcS插入第一個(gè)表達(dá)載體中，將藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB和藻膽蛋白裂合酶cpcT組成多順?lè)醋硬迦氲诙€(gè)表達(dá)載體的一個(gè)表達(dá)框中，將血紅素氧化酶基因Ho1和藻紅膽素還原酶基因pebS組成多順?lè)醋硬迦氲降诙€(gè)表達(dá)載體的另一個(gè)表達(dá)框中；