[發明專利]一種檢測豬非典型瘟病毒的熒光定量RT-PCR引物和探針及方法與應用

有效

• 申請號: 201810581493.0
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108611442B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 張斌;周可磊;岳華;湯承;王遠微
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

本發明公開了一種檢測豬非典型瘟病毒的熒光定量RT?PCR引物和探針及方法與應用，該引物和探針的序列如SEQ ID NO:1～3所示。本發明可快速、特異、靈敏地檢測豬非典型瘟病毒，最低檢測濃度為5copies/μL。本發明使用的操作方法簡單、反應結果易于判斷，靈敏性和檢出率高，并且能夠避免假陽性現象，適用于疾病監測、現場應急及臨床樣品的檢測，適合大范圍推廣應用。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體地說，涉及一種檢測豬非典型瘟病毒的熒光定量RT-PCR引物和探針及方法與應用。

背景技術

豬非典型瘟病毒(Atypical porcine pestivirus，APPV)是近幾年來新發現的一種新型瘟病毒，與豬瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹瀉(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)、邊境瘟病毒(Border disease virus，BDV)等同屬瘟病毒屬(Pestivirus)黃病毒科(Flaviviridae)。其發病特征是在出生后數小時內可觀察到骨骼肌的雙側痙攣收縮，并造成無法吮乳的現象，嚴重時可損傷仔豬的腦和脊髓，并導致仔豬死亡。在臨床上癥狀輕重不一，有的仔豬是全身一致的、有節奏的震顫，無法站立，在躺臥后震顫減輕或停止。有的仔豬全身震顫程度不一，僅頭部、頸部震顫強烈，不能準確吃奶但仍可正常運動。2015年，美國Hause 研究小組檢測并證實了該病毒的存在，同時指出APPV可能導致仔豬先天性震顫。隨后，該病毒在德國、荷蘭、西班牙、奧地利等地相繼被報道。在2017年，該病毒被我國華南農業大學寧永章課題組首次發現。

目前對于豬非典型瘟病毒尚無預防用生物制品，能準確、快捷、有效的檢測豬非典型瘟病毒(APPV)對于提高對該病毒的防控是至關重要的。目前，根據研究數據表明，該病毒的基因序列變異快，不同毒株之間基因序列差異大，國外建立的檢測方法在國內并不適用，而國內已有的普通PCR和熒光檢測試劑盒又易出現假陽性問題，因此其檢測結果的準確性是有待考究的。

由此可見，我國對于該病毒的檢測技術還需要進一步的完善。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種檢測豬非典型瘟病毒的熒光定量RT-PCR 引物和探針及方法與應用，本發明在多株APPV基因序列比對基礎上，基于5’端基因設計了特異性引物和探針，對豬非典型瘟病毒進行快速、準確地鑒別，具有簡單、快速、靈敏度高和特異強的特點。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種檢測豬非典型瘟病毒的熒光定量RT-PCR引物和探針，包括上游引物APPV F、下游引物APPV R以及探針APPV Probe，其中，上游引物APPV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，下游引物APPV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探針APPV Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發明還公開了一種檢測豬非典型瘟病毒的熒光定量RT-PCR的方法，包括以下步驟：提取待檢測樣品的RNA，以待檢測樣品的RNA為模板，反轉錄得到cDNA，用上述的引物和探針對cDNA進行熒光定量RT-PCR 擴增；通過實時熒光定量PCR儀進行結果的讀取，判斷S型擴增曲線和 CT值，在擴增曲線正常的情況下，若CT值＞0時，則可記為陽性，若CT 值＝0時，則記為陰性。

可選地，所述反轉錄的步驟為：將RNA模板4μL、1號5×Prime Script Buffer 4μL、2號Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4號Random 6mers 2μL 和5號RNase Free dH₂O 9μL混勻，放入PCR儀上進行反轉錄。

可選地，所述反轉錄反應所需試劑為寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScript^TMRT試劑。