[發(fā)明專利]一種提高噬菌體侵染細(xì)菌效率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810580501.X
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108795883B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖翔;韓雪;劉朝瑩;呂鵬;李潛
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種提高噬菌體侵染細(xì)菌效率的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明在噬菌體侵染宿主大腸桿菌的過程中，通過添加納米材料，增加噬菌體與細(xì)菌的接觸，從而有效提高噬菌體對大腸桿菌的侵染效率；本發(fā)明能夠顯著提升噬菌體的侵染效率，降低噬菌體的使用量，具有簡易、高效、低成本的特點(diǎn)，在噬菌體表面展示、噬菌體擴(kuò)增等方面具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高噬菌體侵染細(xì)菌效率的方法，主要涉及一種利用納米TiO₂材料提高噬菌體侵染細(xì)菌效率的方法；屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

噬菌體是一類能夠感染細(xì)菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒，具有嚴(yán)格的宿主特異性，對動植物沒有危害性。噬菌體結(jié)構(gòu)簡單、基因數(shù)少，作為一種寶貴的生物資源已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。噬菌體可作為分子生物學(xué)研究的試驗(yàn)工具，用于細(xì)菌的鑒定和分型、噬菌體展示技術(shù)、噬菌體抗體庫，也可用于檢測和控制致病菌，具有重要的理論研究意義和實(shí)際應(yīng)用價值。

大腸桿菌M13單鏈絲狀噬菌體是一類具有單鏈DNA的噬菌體，研究證實(shí)其能感染帶有性菌毛的雄性大腸桿菌。當(dāng)M13噬菌體感染大腸桿菌時，先通過其頭部的pⅢ蛋白N端吸附于大腸桿菌F性菌毛的末端，脫去主要衣殼蛋白pⅧ，其感染性單鏈DNA則進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)菌，并在10～15min內(nèi)，以此環(huán)狀單鏈的DNA為正鏈，通過滾環(huán)復(fù)制拷貝出互補(bǔ)的負(fù)鏈DNA，形成環(huán)狀雙鏈DNA分子即復(fù)制型DNA(RF形式)。當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)RFDNA積累到100～200個拷貝后，則開始轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并產(chǎn)生所有的病毒蛋白。子代噬菌體是以出芽的方式釋放至胞外。M13噬菌體屬于溫和噬菌體，通常降低了細(xì)菌的生長和增殖速度，而不會引起宿主細(xì)菌的裂解與死亡。目前在M13噬菌體侵染過程中，通常使用高噬菌體/大腸桿菌的比率，以確保足夠的侵染率，而這會顯著增加實(shí)驗(yàn)操作的成本。因此，如何提高噬菌體對大腸桿菌的侵染率成為一個亟待解決的問題。

已有報道證明，離子性液體促進(jìn)細(xì)菌菌毛蛋白的表達(dá)量，從而促進(jìn)M13噬菌體的侵染效率。但離子性液體對細(xì)菌及真菌生長均有抑制作用，且隨著烷基鏈的增長毒理學(xué)活性增加，其排放至環(huán)境中會通過吸附作用沉積，難以降解，對環(huán)境造成不良影響。納米TiO₂材料是一種高比表面積的廉價納米材料。它性質(zhì)穩(wěn)定，不釋放有毒金屬離子，且在非光激發(fā)條件下對微生物無毒。納米TiO₂材料可以吸附噬菌體，并結(jié)合于宿主菌體表面，促進(jìn)絲狀噬菌體通過與細(xì)菌菌毛接觸而侵染細(xì)菌，從而增加噬菌體對細(xì)菌的侵染效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提出了一種利用納米TiO₂材料粘附作用增加噬菌體與細(xì)菌的接觸，進(jìn)而提高噬菌體侵染細(xì)菌效率的方法，是一種新型的提高噬菌體侵染效率的方法。本發(fā)明解決了目前噬菌體侵染效率不高的瓶頸，是一種簡易操作、經(jīng)濟(jì)快捷的噬菌體侵染增效方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種提高噬菌體侵染細(xì)菌效率的方法，包括如下步驟：

（1）細(xì)菌培養(yǎng)，離心收集菌體；

（2）配制納米TiO₂材料懸浮液作為母液，超聲并稀釋后待用；

所述納米TiO₂材料懸浮液的濃度為0.05-50 mmol/L，優(yōu)選為0.01-1 mmol/L,更優(yōu)選的為0.5mmol/L；

所述納米TiO₂材料粒徑為5-100nm，優(yōu)選為20-50nm。

所述母液超聲條件為超聲1 h，梯度稀釋后再超聲15 min。

（3）將步驟（1）中收集的菌體加入到PBS緩沖溶液中，并調(diào)節(jié)菌濃至初始濃度為2×10⁸CFU/mL；

（4）將噬菌體用PBS緩沖溶液稀釋，調(diào)節(jié)初始滴度為5×10⁸ PFU/mL；