[發明專利]對蝦肝胰腺病原毒素蛋白PirA的單克隆抗體B及應用

有效

• 申請號: 201810577429.5
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN109369804B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 徐曉麗;張振奎;孟遜;鐘文慧;姚學良;郝俊
• 申請（專利權）人: 天津市水產技術推廣站;艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N5/20;G01N33/569;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明涉及一種對蝦肝胰腺病原毒素蛋白PirA的單克隆抗體B及應用，該單克隆抗體B是由保藏號為：CCTCC NO:C2017153的雜交瘤細胞分泌的，能夠與毒素蛋白PirA表位發生特異性結合。該應用是將該單克隆抗體B應用于對蝦急性肝胰腺壞死病病原檢測，具體是采用斑點印記法檢測對蝦中是否含有PirAB質粒病原。本發明研制的單克隆抗體B能夠與PirA蛋白表位結合，所以使得單克隆抗體B能夠應用到AHPND病原的早期快速檢測中，為建立AHPND病原的單克隆抗體診斷方法，為研究AHPND的發病機理與感染動態、增殖特點、流行病學規律，繼而實現切斷感染途徑、預防控制蝦類AHPND奠定了堅實的基礎。

技術領域

本發明屬于分子免疫學和病原生物學交叉技術領域，是一種對蝦肝胰腺病原毒素蛋白PirA的單克隆抗體及應用，具體是抗對蝦急性肝胰腺壞死病(AcuteHepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)病原毒素蛋白PirA(Photorhabdus insectrelated A，發光桿菌昆蟲毒素關聯基因A)的單抗及其制備與應用。

背景技術

急性肝胰腺壞死病(AHPNS)是近年來引起東南亞乃至全球養殖仔蝦、幼蝦大量死亡的一種疾病。僅在我國，每年造成的直接經濟損失超過10億美元，嚴重危害對蝦產業的發展，已對全球的對蝦養殖及相關產業造成了前所未有的打擊和影響。對于AHPND的病原，初始研究認為是攜帶有特定致病性質粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特異菌株，進一步研究發現，該病可能與致病性質粒所攜帶的PirA和PirB毒素蛋白基因密切相關，臺灣成功大學羅竹芳教授團隊通過一系列感染實驗證實PirAB毒素基因就是誘導AHPND癥狀的毒素基因，其中PirA約13kDa，PirB約50kDa，且PirAB基因操縱子位于不穩定的序列上，有可能在其他微生物間自由進出。后續研究表明PirA和PirB毒素蛋白的三維結構與蘇云金芽抱桿菌分泌的一種昆蟲毒素蛋白非常相似，暗示蘇云金芽抱桿菌也可能引起對蝦肝胰腺的壞死。黃海水產研究所黃倢博士團隊發現坎氏弧菌 (V.Campbellii)也可導致對蝦的AHPND，有證據顯示，早先發現的副溶血弧菌在自然條件下可將對蝦急性肝胰腺壞死癥致病基因PirAB傳遞給坎氏弧菌，使其成為新的致病菌。

目前針對對蝦AHPND，仍無有效的防制措施，如何早期診斷該病就迫在眉睫。現有的分子生物學檢測技術需要復雜的儀器設備，成本較高，不適合基層和現場檢測，免疫學檢測技術可以形成簡便快速的現場檢測產品，應用免疫學檢測技術的關鍵在于制備高質量的抗體，近年來利用單克隆抗體技術，提高了免疫學檢測技術的權威性和特異性，使檢測結果更加可靠。但至今尚無對蝦AHPND毒素蛋白單克隆抗體研制的報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，而提供對蝦肝胰腺病原毒素蛋白PirA 單抗及其制備與應用。本發明擬以毒素蛋白PirA基因所表達的多肽為抗原，應用免疫學方法，制備出抗毒素蛋白PirA的單克隆抗體，為建立AHPND的早期診斷技術及病原受體蛋白的研究提供新的思路。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：

一種對蝦肝胰腺病原毒素蛋白PirA的單克隆抗體B，該單克隆抗體B是由保藏號為：CCTCC NO:C2017153的雜交瘤細胞分泌的，能夠與毒素蛋白PirA 表位發生特異性結合；

所述保藏編號為CCTCC NO:C2017153的雜交瘤細胞名稱為雜交瘤細胞株 3M6，保藏單位為：中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏日期2017年12月28日。

而且，所述CCTCC－C2017153的雜交瘤細胞是根據推測分析PirA蛋白質氨基酸結構特性，人工設計合成PirA多肽-VLP蛋白載體復合物，然后將得到的 PirA多肽-VLP蛋白載體復合物免疫小鼠，將免疫小鼠脾細胞與SP2骨髓瘤細胞融合產生的雜交瘤細胞。

而且，所述PirA多肽-VLP蛋白載體表面偶聯多個拷貝的多肽序列為SQ8：HETDYSHDWTVEPN。